自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对胃癌MGC-803细胞顺铂药物敏感性影响的研究

来源 :福建医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:mqj1965
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目的:探讨3-甲基腺嘌呤对胃癌MGC-803细胞自噬的抑制作用,及对其增殖、凋亡和对顺铂敏感性的影响及可能机制。方法:体外培养人胃癌MGC-803细胞,将其分为空白对照组(Control组)、3-甲基腺嘌呤组(3-MA组)、顺铂组(DDP组)及3-甲基腺嘌呤+顺铂(3-MA+DDP组)。分别采用MTT法检测细胞增殖能力;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;扫描电镜检测自噬体和自噬溶酶体形成情况;免疫组化检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ聚集情况;Elisa法检测细胞核小体表达情况;Western Blot检测自噬相关蛋白Beclin1、PI3KⅢ及凋亡相关蛋白caspase3、caspase9表达情况。结果:1.MTT结果显示随着顺铂浓度的增加(0-15μg/ml)胃癌MGC-803细胞的增殖活力逐渐下降。顺铂对胃癌MGC-803细胞增殖能力的抑制作用具有浓度(0-15μg/ml)依赖性、时间(0-48h)依赖性。其24h半数抑制浓度(IC50)为10.68μg/ml时,48h IC50为8.26μg/ml。2.3-MA组与Control组相比,电镜观察到3-MA组自噬体、自噬溶酶体数量较Control组明显减少。免疫组化LC3Ⅱ平均吸光度3-MA组(923.33±68.07)显著低于Control组(6633.33±351.90)(P<0.05)。Western Blot检测自噬相关蛋白Beclin1相对表达量3-MA组(0.77±0.04)显著低于Control组(1.04±0.08)(P<0.05),PI3KⅢ相对表达量3-MA组(0.78±0.04)显著低于Control组(0.89±0.03)(P<0.05)。细胞增殖能力3-MA组(98.48±2.21%)与Control组(100±0.00%)相比无显著性差异(P>0.05)。克隆形成率3-MA组(94.33±2.01%)与Control组(98.33±2.08%)相比无显著性差异(P>0.05)。核小体形成量3-MA组(68.19±16.27pg/mg)与Control组(65.24±13.33 pg/mg)相比无显著性差异(P>0.05)。Western Blot检测凋亡蛋白caspase3、caspase9相对表达水平3-MA组(0.72±0.04、0.70±0.06)与Control组(0.64±0.06、0.60±0.08)相比无显著性差异(P>0.05)。3.DDP组与Control组相比,电镜观察到与Control组相比DDP组自噬体、自噬溶酶体大量堆积。免疫组化LC3Ⅱ平均吸光度DDP组(12433.33±513.36)显著高于Control组(6633.33±351.90)(P<0.05)。Western Blot检测自噬相关蛋白Beclin1相对表达量DDP组(1.82±0.14)显著高于Control组(1.04±0.08)(P<0.05),PI3KⅢ相对表达量DDP组(1.30±0.89)显著高于Control组(0.89±0.03)(P<0.05)。细胞活力DDP组(56.90±2.21%)显著低于Control组(100±0.00%)(P<0.05)。克隆形成率DDP组(45.00±5.00%)显著低于Control组(98.33±2.08%)(P<0.05)。核小体形成量DDP组(831.52±60.98pg/mg)显著高于与Control组(65.24±13.33 pg/mg)(P<0.05)。Western Blot检测凋亡蛋白caspase3、caspase9相对表达水平DDP组(1.14±0.06、1.22±0.11)显著高于Control组(0.64±0.06、0.60±0.08)(P<0.05)。4.3-MA+DDP组与DDP组相比,电镜观察到3-MA+DDP组自噬体、自噬溶酶体较DDP组明显减少。免疫组化LC3Ⅱ平均吸光度3-MA+DDP组(9866.67±321.46)显著低于DDP组(12433.33±513.36)(P<0.05)。Western Blot检测自噬相关蛋白Beclin1相对表达量3-MA+DDP组(1.52±0.08)显著低于DDP组(1.82±0.14)(P<0.05),PI3KⅢ相对表达量3-MA+DDP组(0.93±0.04)显著低于DDP组(1.30±0.89)(P<0.05)。细胞活力3-MA+DDP组(43.95±3.71%)显著低于DDP组(56.90±2.21%)(P<0.05)。克隆形成率3-MA+DDP组(23.33±3.51%)显著低于DDP组(45.00±5.00%)(P<0.05)。核小体形成量3-MA+DDP组(1083.60±104.15pg/mg)显著高于与DDP组(831.52±60.98pg/mg)(P<0.05)。Western Blot检测凋亡蛋白caspase3、caspase9相对表达水平3-MA+DDP组(1.35±0.08、1.63±0.12)显著高于DDP组(1.14±0.06、1.22±0.11)(P<0.05)。结论:1、顺铂可诱导胃癌MGC-803细胞产生保护性自噬。2、3-甲基腺嘌呤能够抑制顺铂诱导胃癌MGC-803细胞所产生的保护性自噬,抑制其增殖、提高其凋亡水平,提高胃癌MGC-803细胞对顺铂的敏感性。
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