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一、研究背景目前,肺癌的发生率在全世界范围内正呈现升高的趋势,而肺腺癌的比例逐年攀升,且其预后差,严重威胁人类生命安全,并加重了社会医疗资源的负担。然而,早期肺腺癌的发生、发展机制尚不明确。研究表明,在肿瘤的早期阶段,自噬（Autophagy）具有抑制其发生、发展的作用。自噬是一种由氧化应激、损伤等诱发的非凋亡性、程序性细胞死亡方式,包括线粒体自噬、过氧化物酶体自噬、内质网以及核糖体自噬等途径,微管相关蛋白轻链3（Microtubule Associated Light Chain 3,LC3）水解后形成LC3-I,在细胞自噬过程中进一步形成LC3-II,并结合在自噬体膜上,因此以LC3-II/I的比率反映细胞自噬情况;肿瘤的发生、发展与线粒体自噬（Mitophagy）的减少尤为相关,线粒体自噬是指在氧化应激、营养缺乏、细胞衰老等刺激下,线粒体发生去极化损伤后,被特异性包裹进自噬体中,并与溶酶体融合,降解受损线粒体,维持细胞内环境的稳定。线粒体自噬通过清除失功的线粒体,减轻氧化应激,从而防止肿瘤生成。哺乳动物线粒体自噬的发生,主要受到自噬相关基因（Autophagy Related Gene,Atg）、BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白（BCL2/Adenovirus E1B protein-interacting protein,Nix）以及PTEN诱导激酶1-PARK2编码的E3泛素连接酶（PARK2 Coding E3 Ubiquitin Ligase,PINK-Parkin）介导。缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1alpha,Hif-1α）在各种肿瘤组织中均高表达,可以抑制肿瘤细胞自噬的发生,并与肿瘤的分级、淋巴结转移、组织学类型以及术后生存时间都有明显关联,Hif-1的激活主要受到雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路的调控;硫化氢（H2S）是一种体内合成的、具有生物活性的内源性气体信号分子,催化H2S生成的酶主要包括胱硫醚?合成酶（Cystathionine-β-Synthase,CBS）、胱硫醚γ裂解酶（Cystathionine-γ-Lyase,CSE）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-Mercaptopyruvate Sulfurtransfera,3-MST）。在哺乳动物的小气道和肺泡内皮中,CBS和CSE均高表达;研究表明,H2S可以激活mTOR,上调mTOR的磷酸化水平（p-mTOR）,但是H2S在肺腺癌细胞中对Hif-1表达的调控及其机制尚未见报道。研究发现,肺癌患者呼出气中H2S含量明显高出正常人群;我们前期的预实验结果显示,肺腺癌组织中内源性H2S合成酶CSE的蛋白表达量明显高于癌旁组织,提示H2S可能通过mTOR-Hif-1α途径调控线粒体自噬,进而影响肺腺癌发生、发展。二、研究目的探索H2S是否可通过激活mTOR,上调Hif-1α表达,进而抑制肺腺癌细胞的线粒体自噬,影响肿瘤发生、发展的机制,从而为肺腺癌的早期靶向治疗提供新的理论依据和治疗靶点。三、研究方法（一）肺腺癌组织中内源性硫化氢与线粒体自噬相关性研究选取早期原发性肺腺癌患者（术后病理分期I-II期）84例,术中分别取癌组织及癌旁组织,应用Western-blot及RT-PCR等方法分别检测人肺腺癌组织及癌旁组织中线粒体自噬相关基因Nix、Parkin的表达水平,H2S合成酶CBS、CSE的表达水平,以及Hif-1α的蛋白表达水平与mTOR的蛋白表达及磷酸化水平;（二）硫化氢调控线粒体自噬机制的离体研究分别构建过表达及敲低CSE的质粒,并稳定转染A549细胞,并进一步采用MTT法检测各组细胞活力,利用平板克隆实验检测各组细胞增殖能力,利用Transwell迁移及侵袭实验比较各组细胞迁移及侵袭能力,应用RT-PCR、Western-blot技术检测各组细胞线粒体自噬相关基因（Nix、Parkin）的m RNA及蛋白表达水平,应用Western-blot检测各组细胞mTOR、Hif-1α蛋白表达及磷酸化水平,最后研究特异性抑制mTOR对Hif-1α蛋白表达、线粒体自噬及A549细胞活力和迁移力的影响,以及特异性抑制Hif-1α对线粒体自噬及A549细胞活力和迁移力的影响;（三）硫化氢调控线粒体自噬,影响肿瘤生物学行为的在体验证研究将CSE上调或下调的A549细胞植入裸鼠模型皮下,与对照组进行比较,观察各组裸鼠模型皮下种植肿瘤生长及局部、远处淋巴结转移情况,并以RT-PCR、Western-blot技术检测各组种植肿瘤线粒体自噬相关基因（Nix、Parkin）的蛋白及m RNA表达水平,以及CSE、Hif-1α、p-mTOR的蛋白表达水平。四、结果（一）肺腺癌组织中内源性硫化氢与线粒体自噬相关性研究1、人肺腺癌组织的自噬及线粒体自噬水平均明显低于癌旁组织在人肺腺癌组织中,LC3-II/I比率明显低于癌旁组织（0.26±0.13 vs 0.67±0.34,P=0.000）;Nix的m RNA（58.0±6.1 vs 100.0±4.3,P=0.000）和蛋白（46.1±8.1 vs 100.0±3.3,P=0.000）的表达水平均明显低于癌旁组织;Parkin的m RNA（68.2±4.1 vs 100.0±2.3,P=0.000）和蛋白（42.1±8.5 vs 100.0±3.0,P=0.000）的表达水平亦均明显低于癌旁组织。2、人肺腺癌组织中内源性硫化氢水平明显高于癌旁组织肺腺癌组织中的CBS m RNA（143.1±10.5 vs 100.0±4.5,P=0.000）和蛋白表达水平（132.4±5.9 vs 100.0±7.5,P=0.000）均明显高于癌旁组织;CSE的m RNA（143.4±11.7vs 100.0±3.8,P=0.000）和蛋白表达水平（137.3±5.4 vs 100.0±6.5,P=0.000）亦均明显高于癌旁组织。3、人肺腺癌组织Hif-1α蛋白表达水平及mTOR磷酸化水平均明显高于癌旁组织肺腺癌组织中的Hif-1α蛋白表达水平明显高于癌旁组织（123.6±8.0 vs 100.0±8.8,P=0.000）;mTOR磷酸化水平（p-mTOR）明显高于癌旁组织（126.7±8.0 vs 100.0±13.6,P=0.000）;但肺腺癌组织及癌旁组织中mTOR蛋白水平（100.0±17.5 vs 100.0±15.6,P=0.93）的差别无统计学意义。（二）硫化氢调控线粒体自噬机制的离体研究1、硫化氢下调A549细胞的自噬水平CSE敲低组A549细胞自噬率显著高于对照组及CSE过表达组（38.1%±4.6%vs15.7%±0.7%,11.3%±0.6%,P=0.000,0.000）;而CSE过表达组A549细胞自噬率较对照组显著降低（11.3%±0.6%vs 15.7%±0.7%,P=0.025）;CSE敲低组细胞LC3-II/I比率显著高于对照组(3.75±0.45 vs 0.72±0.10,P=0.000;而CSE过表达组显著低于对照组及敲低组（0.28±0.05 vs 0.72±0.10,3.75±0.45,P=0.0024,0.000）。在CSE敲低的A549细胞培养清中加入较低浓度的外源性H2S（供体为GYY4137）,浓度分别为:10u M,30u M,50u M。与CSE敲低组相比,各组LC3-II/I比率下降（2.19±0.25 vs.1.69±0.14,1.25±0.13,1.00±0.094,P=0.000,0.000,0.000,0.000）,提示低浓度外源性H2S能够显著下调A549细胞的自噬水平。2、硫化氢下调A549细胞的线粒体自噬水平与对照组相比,CSE敲低组的Nix、Parkin的m RNA（189.05±10.81 vs 100.00±4.02,P=0.000）、（179.67±12.60 vs 100.00±11.66,P=0.000）及蛋白（164.31±12.91 vs100.00±3.84,P=0.000）、（169.18±11.57 vs 100.00±9.90,P=0.000）的表达水平明显增高;CSE过表达组与对照组及CSE敲低组相比,Nix、Parkin的m RNA（45.32±6.70 vs100.00±4.02,189.05±10.81,P=0.000,0.000）、（45.32±6.70 vs 100.00±4.02,179.67±12.60,P=0.000,0.000）及蛋白（35.56±5.11 vs 100.00±3.84,164.31±12.91,P=0.000,0.000）、（37.39±5.52 vs 100.00±9.90,169.18±11.57,P=0.000,0.000）的表达水平均明显降低。3、硫化氢增强A549细胞活力、迁移力及侵袭力CSE敲低组A549细胞培养第四天的活力低于A549细胞对照组及CSE过表达组（0.69±0.17 vs 1±0.10,1.37±0.10,P=0.024,0.001）;CSE过表达组细胞活力高于对照组（1.37±0.10 vs 1±0.10,P=0.012）。CSE敲低组A549细胞迁移力低于对照组及CSE过表达组A549细胞（25.0±3.8 vs33.4±5.9,42.4±4.5,P=0.018,0.000）;CSE过表达组的细胞迁移力显著高于敲低组（42.4±4.5 vs 33.4±5.9,P=0.000）。CSE敲低组A549细胞侵袭力低于对照组及CSE过表达组A549细胞（19.6±1.1 vs24.8±2.6,28.6±2.6,P=0.003,0.000）;CSE过表达组的细胞侵袭力显著高于敲低组（28.6±2.6 vs 19.6±1.1,P=0.000）。4、硫化氢通过mTOR-Hif-1α-线粒体自噬的途径,促进A549细胞生长、迁移CSE敲低组的p-mTOR的蛋白相对表达量较对照组明显下降（0.58±0.050 vs0.99±0.040,P=0.006）,再向CSE敲低组细胞中,加入低浓度外源性H2S（供体为GYY4137）,当其浓度为10u M时,p-mTOR的蛋白相对表达量（0.66±0.19 vs 0.58±0.050,P=0.40）无明显提高,而当外源性H2S浓度进一步增加时（30u M,50u M）,较CSE敲低组相比,p-mTOR蛋白的相对表达随着外源性H2S浓度而显著升高（0.58±0.050 vs0.90±0.33,1.07±0.28,P=0.026,0.001）,提示外源性H2S能够激活mTOR。给予外源性H2S后,再给予mTOR特异性抑制剂雷帕霉素（Rap）,A549细胞的线粒体自噬水平上升,而Hif-1α蛋白表达及细胞活力、迁移力等下降;而给予外源性H2S后,再给予Hif-1α特异性抑制剂YC-1,A549细胞的线粒体自噬水平上升,细胞活力、迁移力下降。提示H2S可通过mTOR—Hif-1α通路,下调A549细胞自噬及线粒体自噬水平,使A549肺腺癌细胞的活力、迁移力明显增强。（三）硫化氢调控线粒体自噬,影响肿瘤生物学行为的在体验证研究1、H2S促进裸鼠模型皮下种植腺癌组织的生长及局部、远处淋巴结转移CSE过表达组裸鼠较对照组及CSE敲低组相比,其皮下种植肿瘤重量（3.24±0.31vs 1.96±0.27,1.38±0.15,P=0.000,0.000）、后肢（局部）淋巴结转移（3.20±0.63 vs2.20±0.63,1.50±0.53,P=0.001,0.000）以及腹腔内（远处）淋巴结转移（2.10±0.57 vs1.60±0.52,1.10±0.32,P=0.027,0.000）均明显增加;而CSE敲低组与对照组相比,皮下种植肿瘤肿瘤（1.38±0.15 vs 1.96±0.27,P=0.000）、后肢（局部）淋巴结转移（1.50±0.53 vs 2.20±0.63,P=0.015）及腹腔内（远处）淋巴结转移（1.10±0.32 vs1.60±0.52,P=0.027）均明显减少;2、H2S通过mTOR-Hif-1α-线粒体自噬的途径调控早期肺腺癌的发生、发展在CSE过表达组种植瘤组织中,Hif-1α、p-mTOR蛋白相对表达量均较对照组及CSE敲低组显著增高（212.33±55.78 vs 100.00±7.06,45.44±11.09,P=0.001,0.000）、（180.93±17.49 vs 100.00±6.10,46.51±10.71,P=0.000,0.000）,CSE敲低组的Hif-1α蛋白较对照组降低（45.44±11.09 vs 100.00±7.06,P=0.045）,CSE敲低组的p-mTOR蛋白较对照组显著降低（46.51±10.71 vs 100.00±6.10,P=0.000）。与对照组及CSE敲低组相比,CSE过表达组种植肿瘤组织中,线粒体自噬相关Nix、Parkin的m RNA表达水平（53.75±7.17 vs 100.00±7.99,198.20±27.35,P=0.000,0.000）、（43.81±16.01 vs 100.00±19.52,183.81±23.56,P=0.003,0.000）和蛋白表达（40.36±11.29 vs 100.00±9.86,194.24±61.74,P=0.047,0.000）、（36.72±7.47 vs100.00±10.73,190.32±19.81,P=0.000,0.000）均显著降低,而CSE敲低组较对照组的Nix、Parkin的m RNA（198.20±27.35 vs 100.00±7.99,P=0.000）、（183.81±23.56 vs100.00±19.52,P=0.000）及蛋白（194.24±61.74 vs 100.00±9.86,P=0.005）、（190.32±19.81vs 100.00±10.73,P=0.000）的相对表达均显著增加。五、结论1、人肺腺癌组织中,内源性硫化氢生成水平增高,伴有自噬及线粒体自噬水平降低;2、一定浓度的硫化氢能促进裸鼠皮下种植瘤组织的生长及局部和远处淋巴结转移;3、硫化氢可显著降低A549细胞系的线粒体自噬水平,增强其细胞活力、迁移力及侵袭力;4、硫化氢可通过mTOR-Hif-1α通路下调A549细胞系线粒体自噬的发生,并具有浓度依赖性;5、硫化氢可通过调控线粒体自噬水平,影响早期肺腺癌的发生、发展。