第一部分探讨MyD88抑制剂TJ-M2010-5对小鼠感染性急性肝损伤的保护作用【目的】内毒素血症和肝损伤关系密切,互为因果。在肝脏受损的同时常常发生程度不等的肠源性内毒素血症(intestinal endotoxemia,IETM),IETM则进一步加重肝脏损害,引起肝功能衰竭。本研究以D-gal/LPS诱导的小鼠急性肝损伤为模型,自主研发的MyD88抑制剂TJ-M2010-5为治疗手段,MyD88基因缺陷小鼠为对照,探讨髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88)在内毒素诱导的急性肝损伤中的治疗靶点作用。【方法】1、体内实验选取体重23-25g的雄性BALB/c小鼠,腹腔注射右旋半乳糖胺(D-gal)(800mg/kg)+脂多糖(LPS)(80μg/kg)建立小鼠急性肝衰竭模型。(1)Western Blot和实时荧光定量PCR检测建模后小鼠肝脏中MyD88在m RNA及蛋白水平表达变化情况。(2)实验小鼠分为4组:正常对照组(A组):腹腔注射与D-gal/LPS等剂量的生理盐水;模型组(B组):腹腔注射D-gal/LPS,同时予以0.5%CMC溶剂对照(给予方式同TJ-M2010-5);TJ-M2010-5组(C组):腹腔注射D-gal/LPS前,连续三天每天予以腹腔注射TJ-M2010-5;MyD88缺陷小鼠组(D组):BALB/c背景下MyD88基因缺陷小鼠腹腔注射D-gal/LPS。观察各组小鼠48小时内生存情况。收集建模后12小时小鼠血清,检测ALT和AST含量以反映肝功能变化,检测IL-1β、TNF-α和IL-6等细胞因子表达水平以反映全身炎症情况,检测i NOS和COX2表达水平反映氧化应激损伤程度。收集建模后12小时和24小时小鼠肝脏组织,TUNEL染色检测肝脏细胞凋亡情况,H&E染色检测肝脏急性损伤程度和免疫细胞浸润情况。免疫荧光染色分别检测建模后6小时和12小时肝组织中TNF-α表达水平。提取肝脏组织总RNA,实时荧光定量PCR检测肝内IL-1β、TNF-α、IL-6、i NOS和COX2等转录水平。提取肝脏组织总蛋白,检测MyD88上游蛋白TLR4表达水平,TNF-α受体TNFR1蛋白表达水平以及P38、ERK、JNK等蛋白磷酸化水平。提取肝脏组织核蛋白及浆蛋白,检测NF-κB核转移情况和NF-κB抑制蛋白IκB-α的表达。获取建模6小时后小鼠肝脏组织,Percoll梯度离心法提取肝内单个核细胞,标记流式抗体PE-F4/80、FITC-CD80、APC-CD86,流式细胞术检测F4/80+细胞中CD80+/CD86+细胞比例,反映肝脏内巨噬细胞活化情况。(3)氯弗松(Clophosome)清除小鼠体内巨噬细胞,再予以D-gal/LPS刺激。q RT-PCR检测12小时肝脏组织中IL-1β、TNF-α、IL-6、i NOS和COX2等转录水平;H&E染色检观察24小时肝脏病理变化。2、体外实验提取6-8周雄性BALB/C小鼠骨髓细胞体外培养,加入巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激诱导向巨噬细胞分化,培养第6天开始实验。骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)予以不同浓度的MyD88抑制剂TJ-M2010-5(0、5、10、30μmol/L)处理2小时后,再用LPS刺激12小时,收集细胞及培养上清。流式细胞术检测F4/80+CD80+和F4/80+CD86+细胞比例;提取细胞总RNA,q RT-PCR检测IL-1β、TNF-α、IL-6、i NOS和COX2等转录情况;ELISA检测细胞培养上清IL-1β、TNF-α、IL-6、i NOS和COX2等的蛋白表达水平。【结果】1、体内实验(1)D-gal/LPS刺激后,小鼠肝脏组织MyD88在m RNA及蛋白水平均高表达,与A组小鼠比较有明显统计学差异(P<0.01)。(2)B组小鼠在48小时内全部死亡,而C组和D组小鼠存活率分别达73.3%和80%。建模后12小时,B组小鼠血清ALT、AST含量明显上升,而C组和D组小鼠血清ALT、AST含量模型组明显下降(P<0.01)。建模24小时肝脏标本H&E染色提示,B组小鼠肝脏组织出现大片坏死,肝细胞核碎裂或消失,伴有大量炎性细胞浸润;C、D组可见肝细胞水样变,但无明显坏死,炎性细胞浸润较B组明显减少。同时,TUNEL染色结果也证实抑制或敲除MyD88能明显减轻D-gal/LPS诱导的肝细胞凋亡。注射D-gal/LPS后,小鼠肝脏中巨噬细胞大量激活,流式细胞术检测小鼠肝脏内F4/80+CD80+/CD86+细胞比例明显升高,而抑制或敲除Myd88能够明显降低D-gal/LPS小鼠肝脏内F4/80+CD80+/CD86+细胞比例(P<0.05)。另外,q RT-PCR检测D-gal/LPS小鼠肝组织IL-1β、TNF-α、IL-6、i NOS和COX2等m RNA水平,以及ELISA检测小鼠血清中上述炎性因子蛋白表达含量,结果提示肝脏局部及全身炎性因子表达水平均较正常对照组升高(P<0.01),而抑制或敲除Myd88均能降低小鼠肝脏局部及全身炎性因子表达水平(P<0.01)。TNF-α免疫荧光染色结果与q RT-PCR结果一致,抑制或敲除Myd88组织TNF-α荧光强度明显降低。Western Blot结果提示,D-gal/LPS刺激小鼠后肝组织中的LPS配体TLR4蛋白较正常小鼠高表达,同时MAPK信号通路中P38、ERK、JNK等蛋白磷酸化水平升高,NF-κB入核明显增多,NF-κB抑制蛋白IκB-α表达下降,TNF-α受体TNFR1蛋白表达升高;抑制或敲除Myd88可使肝组织内TLR4、TNFR1蛋白表达和NF-κB入核减少,P38、ERK、JNK等蛋白磷酸化水平降低,并减少IκB-α下降水平。Western Blot结果均有统计学差异(P<0.05)。(3)氯弗松清除小鼠体内巨噬细胞后,明显改善D-gal/LPS诱导的小鼠肝脏损伤,并且降低肝组织内炎性因子的高表达。2、体外实验LPS刺激BMDMs后,流式细胞术检测F4/80+CD80+和F4/80+CD86+细胞比例明显升高;而TJ-M2010-5预处理后可降低F4/80+CD80+和F4/80+CD86+细胞比例,并呈浓度梯度依赖性。实时荧光定量PCR结果提示LPS刺激促进BMDMs转录IL-1β、TNF-α、IL-6、i NOS和COX2等,而TJ-M2010-5预处理可降低这些因子的转录。ELISA检测细胞培养上清中炎性因子分泌情况,结果与上述一致,BMDMs经LPS刺激后大量分泌IL-1β、TNF-α、IL-6、i NOS和COX2等因子,TJ-M2010-5预处理可降低这些因子的分泌。【结论】1、MyD88分子参与了D-gal/LPS诱导的小鼠急性肝损伤的病理生理过程;2、抑制或敲除MyD88分子对D-gal/LPS诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用;3、这种保护效果主要源自于对NF-κB和MAPK信号通路的抑制,从而抑制肝脏巨噬细胞激活,减少炎性因子的分泌,改善炎性微环境发挥保护肝细胞的作用。第二部分探讨MyD88抑制剂TJ-M2010-5对小鼠自身免疫性肝损伤的保护作用【目的】Con A诱导肝损伤是模拟自身免疫性肝炎的很好模型,本研究探讨MyD88抑制剂TJ-M2010-5对Con A诱导的小鼠急性免疫性肝损伤的保护作用,以及对T细胞和巨噬细胞的影响。【方法】选取体重23-25g的雄性BALB/c小鼠,尾静脉注射刀豆蛋白A(Con A)建立急性免疫性肝炎模型。实验小鼠分为四组:正常对照组,尾静脉注射与Con A等剂量的生理盐水;模型组,尾静脉注射Con A,并前三天开始每天予以腹腔注射0.5%CMC溶剂;TJ-M2010-5组,尾静脉注射Con A前三天开始每天予以腹腔注射TJ-M2010-5;MyD88缺陷组,BALB/c背景MyD88基因缺陷小鼠尾静脉注射Con A。首先,按25mg/kg剂量尾静脉注射Con A建立致死性肝炎模型,观察各组小鼠24小时生存情况。再按15mg/kg剂量尾静脉注射Con A建立可逆性肝炎模型,WB和q RT-PCR检测建模后肝组织MyD88表达水平变化;收集各组小鼠12小时血清,检测ALT、AST和ALP含量以反映肝功能情况;获取各组小鼠肝脏,观察肝组织大体改变,H&E染色检测肝脏急性损伤程度和免疫细胞浸润情况,TUNEL染色检测肝脏细胞凋亡情况;提取肝组织RNA,q RT-PCR检测肝内炎性因子IL-4、IFN-γ、IL-1β、TNF-α转录水平;提取肝组织蛋白,检测MDA和SOD水平反应肝脏氧化应激损伤情况;分离肝内单个核细胞,流式细胞术检测正常对照组、模型组和TJ-M2010-5组小鼠肝内T细胞和巨噬细胞活化情况。提取小鼠淋巴结淋巴细胞和骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)体外培养,复苏小鼠正常肝细胞株AML-12并培养传代。CCK-8实验检测Con A分别对小鼠淋巴结淋巴细胞、BMDMs和AML-12是否具有增殖作用,以及不同浓度TJ-M2010-5对这三种细胞是否有细胞毒性作用。Con A体外刺激小鼠淋巴结淋巴细胞,TJ-M2010-5预干预,流式细胞术检测T细胞激活情况;q RT-PCR检测T细胞炎性因子IL-4、IFN-γ、IL-1β、TNF-α转录水平。Con A体外刺激BMDMs,流式细胞术检测BMDMs极化情况;q RT-PCR检测BMDMs炎性因子TNF-α、IL-1β转录水平。将Con A体外刺激小鼠淋巴结淋巴细胞后的培养上清与BMDMs混培,TJ-M2010-5预干预,流式细胞术检测BMDMs极化情况及TNF-α表达水平;q RT-PCR检测BMDMs炎性因子TNF-α、IL-1β转录水平;WB检测混培后BMDMs的MyD88蛋白表达水平以及TJ-M2010-5预干预后NF-κB入核情况。Con A体外刺激小鼠淋巴结淋巴细胞后的培养上清与AML-12混培,流式细胞术检测AML-12凋亡情况;CCK-8实验检测AML-12活性;WB检测HMGB1在AML-12细胞胞核、胞浆中的表达,HSP60的表达,以及TJ-M2010-5预干预后HMGB1在AML-12细胞胞浆中的表达。Con A、小鼠淋巴结淋巴细胞、BMDMs混培,混培上清再与AML-12混培,TJ-M2010-5预干预,流式细胞术检测AML-12凋亡情况。【结果】致死剂量下,模型组小鼠注射Con A后8小时开始死亡,24小时内死亡率达73.3%。而TJ-M2010-5组和MyD88缺陷组注射Con A后24小时内死亡率分别为13.3%和0,与模型组比较具有显著的统计学差异(P<0.001)。尾静脉注射非致死剂量Con A后,小鼠肝组织中MyD88分子在蛋白和RNA水平均较对照组明显升高,表明MyD88参与了Con A诱导的急性肝炎肝损伤过程。收集各组小鼠12小时血清,模型组ALT、AST和ALP含量明显升高,而TJ-M2010-5组和MyD88缺陷组小鼠ALT、AST和ALP含量较模型组明显下降(P<0.001)。大体标本模型组可见小鼠肝脏片状坏死灶,而TJ-M2010-5组和MyD88缺陷组小鼠肝脏无明显坏死。12小时肝组织H&E染色提示正常对照组肝细胞形态正常,小叶结构清晰;模型组肝组织大片坏死,大量肝细胞核碎裂或消失,大量炎性细胞浸润;TJ-M2010-5组和MyD88缺陷组肝组织无明显坏死,少量肝细胞水样变,少量炎性细胞浸润。12小时肝组织TUNEL染色提示模型组肝细胞凋亡数量明显增多,而TJ-M2010-5组和MyD88缺陷组肝细胞无明显凋亡。模型组小鼠肝内炎性因子IL-4、IFN-γ、IL-1β、TNF-α转录量明显升高,而TJ-M2010-5组和MyD88缺陷组小鼠肝内上述炎性因子水平较模型组明显下降,差异均有显著统计学意义。检测氧化应激损伤指标,结果提示模型组小鼠肝脏MDA较正常对照组明显上升,SOD较正常对照组明显下降;而TJ-M2010-5预干预或敲除MyD88可将小鼠肝脏MDA和SOD含量向正常水平纠正。提取小鼠肝内单个核细胞,行流式细胞术检测各组小鼠肝内T细胞和巨噬细胞活化情况,结果提示模型组和TJ-M2010-5组肝内CD3+CD69+细胞比例均较正常对照组明显上升,提示TJ-M2010-5预干预不能逆转肝内T细胞激活;模型组肝内F4/80+CD80+CD86+细胞比例明显上升,而TJ-M2010-5组肝内F4/80+CD80+CD86+细胞比例较模型组明显下降,差异具有统计学意义(P<0.001),提示TJ-M2010-5预干预可以抑制肝内巨噬细胞激活。CCK-8实验结果提示Con A可以浓度依赖性地促进小鼠淋巴结淋巴细胞增殖,而对BMDMs和AML-12无明显影响;TJ-M2010-5在30μmol/L浓度范围内,对小鼠淋巴结淋巴细胞、BMDMs和AML-12无细胞毒性作用。提取小鼠淋巴结淋巴细胞,流式细胞术结果表明90%以上为CD3+细胞,提示小鼠淋巴结淋巴细胞以T细胞为主;予以Con A刺激,可浓度依赖性地升高CD3+CD4+CD69+和CD3+CD8+CD69+细胞比例,但Con A对CD4+/CD8+比例无影响,提示Con A可直接刺激T细胞激活;而TJ-M2010-5预干预不能抑制Con A对T细胞的激活作用。另外,q RT-PCR结果提示,Con A刺激淋巴细胞可诱导IL-4、IFN-γ、TNF-α转录,而对IL-1β无明显影响;TJ-M2010-5预干预不能抑制IL-4、IFN-γ、TNF-α的转录水平。体外培养BMDMs,Con A刺激,流式结果提示Con A不能提高F4/80+CD11c+细胞比例;q RT-PCR结果提示炎性因子TNF-α、IL-1β水平无明显变化,综上说明Con A不能引起BMDMs向M1型极化。将Con A体外刺激小鼠淋巴结淋巴细胞后的培养上清与BMDMs混培,流式检测结果提示F4/80+CD11c+细胞比例较对照组明显上升,TJ-M2010-5预干预BMDMs,可浓度依赖性地减少F4/80+CD11c+细胞比例,也可减少F4/80和TNF-α双阳性细胞比例,而未予Con A刺激的小鼠淋巴结淋巴细胞培养上清不能提高F4/80+CD11c+细胞比例;q RT-PCR结果提示Con A刺激小鼠淋巴结淋巴细胞后的培养上清可促进BMDMs转录炎性因子TNF-α、IL-1β,TJ-M2010-5预干预可以浓度依赖性地减少TNF-α、IL-1β转录;WB结果提示Con A刺激小鼠淋巴结淋巴细胞后的培养上清可使BMDMs高表达MyD88,并促进NF-κB入核,TJ-M2010-5预干预后可减少NF-κB入核,而未予Con A刺激的小鼠淋巴结淋巴细胞培养上清不能使BMDMs高表达MyD88,同时NF-κB入核不明显。流式细胞术检测细胞凋亡结果提示,Con A、Con A体外刺激小鼠淋巴结淋巴细胞后的培养上清以及Con A和小鼠淋巴结淋巴细胞、BMDMs的三者混培上清均可促进AML-12细胞凋亡,TJ-M2010-5预干预可减少Con A和小鼠淋巴结淋巴细胞、BMDMs的三者混培上清促进AML-12凋亡的细胞比例;CCK-8实验提示Con A体外刺激小鼠淋巴结淋巴细胞后的培养上清可以抑制AML-12细胞活性;WB结果提示Con A体外刺激小鼠淋巴结淋巴细胞后的培养上清促进AML-12细胞核内HMGB1向核外释放,并高表达HSP60;而TJ-M2010-5预干预后对HMGB1向核外释放无抑制作用。【结论】1、抑制MyD88对Con A诱导的小鼠急性免疫性肝炎肝损伤具有保护作用;2、Con A小鼠体内巨噬细胞激活信号来源于多种途径,包括肠源性的PAMPs,T细胞激活后释放的炎性因子,肝细胞受损后释放的DAMPs;3、抑制MyD88可以抑制Con A小鼠体内巨噬细胞激活,但不能抑制T细胞激活。