miRNA是一类长度约为22nt的非编码小RNA分子,其通过与靶基因互补配对降解靶基因mRNA或抑制翻译的方式在动植物的生理过程中起着重要的调控功能。目前,关于miRNA的研究主要聚焦于细胞内miRNA对自身物种的功能研究。例如,植物miRNA能调控根、茎、叶、花和果实的生长发育,动物miRNA在器官的发育方面也起着重要的调控作用。最近,有研究报道释放型miRNA能从细胞被分泌到体液,并能在哺乳动物的体液中循环运动,稳定存在。这些释放型miRNA能被脂蛋白或其它RNA结合分子运载、或被微囊泡包裹,从而在苛刻的环境(例如RNA酶含量高的环境、pH极高或极低的环境)中也能保持较高的稳定性。体液中的循环型miRNA能被引导到靶细胞以调节靶基因的表达水平。2011年,张辰宇等人发现水稻衍生的miRNA能穿过哺乳动物的胃肠道进入小鼠的血液、肝脏和其它组织中,水稻的miR168在小鼠的肝脏组织中能通过降低低密度脂蛋白受体衔接蛋白(LDLRAP1)的水平,调节小鼠的胆固醇水平。该研究为动物摄取的食物遗传调控以及基因工程食物提供了新的视野、也为利用小分子核酸预防或治疗疾病提供了可能。然而,最近几个关于小鼠、尾纤猕猴和昆虫(玉米螟和草地贪夜蛾)的研究表明,以上几种动物摄食植物衍生的食物后,均在其体内检测不到植物源miRNA。本研究中,我们利用寡食性昆虫-家蚕和桑叶这对组合,探究家蚕摄食桑叶后,桑树的miRNA是否进入了家蚕的体内。利用Illumina高通量测序方法对野生桑(川桑)、栽培桑(湖桑32号和伦教109)叶片以及家蚕血淋巴小RNA进行大规模测序,分析鉴定桑叶的miRNA,利用生物信息学方法分析家蚕血淋巴中是否存在桑树源miRNA。采用茎环PCR、T-A克隆、Sanger测序验证该结果,并探究了桑树源miRNA是否广泛存在家蚕的组织中。利用微滴数字PCR技术检测人工合成的miR166b是否也能进入家蚕的体内。另外,采用转录组测序、RT-PCR以及表型调查等方法探究桑树源miR166b对家蚕的生理活动是否有影响。获得的主要结果如下：1.利用高通量测序技术鉴定川桑的保守miRNA和新miRNA要研究桑树miRNA是否进入家蚕,首先对桑树miRNA的种类和含量进行系统鉴定,于是本研究采用solexa技术对川桑3个组织(叶、皮和雄花)的小RNA文库进行高通量测序,利用生物信息学方法,在川桑的3个组织中共鉴定到85个保守miRNA,分属于31个家族,262个新miRNA,分别位于川桑基因组的371个位点上。采用miRNA靶基因预测的方法,20个保守miRNA家族和113个新miRNA分别预测得到89和332个候选靶基因。川桑保守niRNA的进化保守性分析表明川桑大部分niRNA同其它双子叶和单子叶植物都较为保守。表达水平分析表明川桑保守miRNA家族的表达水平范围较广,具有组织倾向性,叶、皮和雄花组织倾向性表达的miRNA家族分别是5个、5个和8个。RT-PCR结果显示部分保守miRNA在叶、皮和雄花的表达谱模式同高通量测序结果一致。川桑新miRNA的特点分析表明,新miRNA前体长度范围与其它已报道的植物相似；最小折叠自由能平均值低于tRNA和rRNA;鉴定到90个新miRNA对应miRNA*序列,进一步表明了新预测miRNA的准确性。表达水平分析表明新miRNA的表达水平也较为宽广,总体表达水平远低于保守miRNA,也具有组织倾向性,其中58个、84个和72个分别具有叶、皮和雄花组织倾向性表达模式。选取部分新miRNA进行RT-PCR验证,结果显示其在3个组织的表达模式与高通量测序的结果一致。川桑miRNA靶基因注释结果表明保守miRNA的候选靶基因绝大部分是转录因子,新miRNA的靶基因是功能蛋白。川桑保守"miRNA-靶基因”组合同其它已报道植物比较发现,保守miRNA和其对应靶基因在几乎所有的植物中都是保守的,表明了这些"miRNA-靶基因”组合对植物的生命活动可能起着相同的调节功能,例如涉及营养器官和生殖器官的生长发育。部分候选靶基因的RT-PCR结果与其对应miRNA在3个组织中的表达模式结果表明,miRNA预测的靶基因部分能与miRNA的表达呈现相反模式,符合miRNA对靶基因的调控方式。本部分研究通过高通量测序技术鉴定了川桑保守miRNA、新miRNA以及其候选靶基因,对桑树miRNA的功能分析和家蚕体内是否有桑树源miRNA的研究提供了基础数据。2.栽培桑miRNA的鉴定及其与野生桑miRNA的比较分析之前我们对川桑(野生桑)叶片进行了miRNA的鉴定,但是家蚕摄食的是栽培桑桑叶,于是本部分研究采用solexa测序对两个栽培桑品系(湖桑32号和伦教109)叶片miRNA进行鉴定并比较分析了野生桑和栽培桑之间的差异。结合miRBase的第21版释放数据,共鉴定到两个栽培桑品系以及川桑的保守miRNA分别是192个、180个和151个,湖桑32号和伦教109的新miRNA分别是177个和167个。三者共有的保守miRNA是137个,表明野生桑和栽培桑的miRNA种类差异不大。表达水平差异分析表明野生桑(川桑)和栽培桑(湖桑32号和伦教109)的差异保守miRNA共有100个,其中75个miRNA在栽培桑中上调表达,25个下调表达；差异新miRNA共有266个,其中89个新miRNA在栽培桑中上调表达,177个下调表达,虽然差异表达的miRNA数目较多,但是表达量高的差异表达miRNA较少,RPM值在100以上的只有6个。说明了野生桑(川桑)和两个栽培桑miRNA整体的表达水平大同小异。同时我们也分析了这些差异miRNA可能与川桑和栽培桑之间的关系。差异表达miRNA对应靶基因的KEGG分析表明,野生桑和栽培桑参与碳水化合物和氨基酸代谢的差异miRNA对应靶基因数目最多,暗示了二者在糖类和蛋白质含量可能有所差异。本部分研究表明栽培桑和野生桑在miRNA的种类和表达水平上大同小异,说明用川桑数据进行下一步的分析是可行的。3.家蚕血淋巴小RNA种类的鉴定和分析为探究家蚕体内是否有桑树源miRNA,本部分研究采用高通量测序技术对家蚕血淋巴小RNA文库进行测序,通过分析共鉴定的小RNA种类包括：桑树源miRNA,家蚕的miRNA、tsRNA、rRNA、snRNA以及snoRNA。家蚕血淋巴小RNA和桑树miRNA的比对分析结果表明,家蚕血淋巴中有8个桑树源miRNA,包括mno-miR166b,mno-miR166c,mno-miR167e, mno-miR396b, mno-miR156c,mno-miR398,mno-miR162,mno-miR159a,其总体的表达量非常低,最高的reads数只有11。该结果表明家蚕摄食桑叶后,部分桑树miRNA能够穿过家蚕的消化道进入家蚕的体内,但是由于检测到的桑树源miRNA含量较低,也不能排除这一结果是由于高通量测序带来的误差或是样品收集过程中桑叶带来的污染。家蚕血淋巴小RNA和已报道的家蚕miRNA的比对结果表明,家蚕血淋巴中共有133个已知miRNA和6个新miRNA,其整体表达水平远远低于其在家蚕的其它组织(例如脂肪体、丝腺等),推测其原因可能是血淋巴中的miRNA大部分来源于血细胞中的miRNA和组织细胞分泌的miRNA。此外,我们还发现,血淋巴小RNA长度分布结果表明血淋巴中含量最高的小RNA是tRNA衍生的小RNA(tsRNA),分别占据两个小RNA文库总量的86.99%和92.04%,长度分布主要在25-28nt区间。tsRNA分类结果表明,家蚕血淋巴中含量前2位分别是tsRNA-Asp(GAC)和tsRNA-His(CAC)。以上两种tsRNA在其对应的tRNA的位置分布结果表明几乎99%都位于tRNA的5’端。此外,tsRNA-Asp(GAC)和tsRNA-His(CAC)在家蚕体液和组织中的表达水平分析表明,这两个tsRNA仅在家蚕血淋巴中高量表达,在全蚕、脂肪体和丝腺中极微量表达,以上结果暗示家蚕的tsRNA-Asp(GAC)和tsRNA-His(CAC)可能在血淋巴中起着特殊的作用。该研究利用二代测序法和生物信息学方法对家蚕血淋巴的小RNA种类进行了分析,对家蚕血淋巴中miRNA、tsRNA的功能研究和桑树源miRNA跨界转运到家蚕的研究提供了数据支撑。4.桑树miR166b对家蚕的跨界调节研究家蚕血淋巴小RNA和桑树miRNA的比对分析结果显示,家蚕血淋巴中有8个桑树源miRNA。本研究对桑树源的miRNA是否真正进入了家蚕体内进行了验证,并研究了进入家蚕体内的桑树源miRNA对家蚕的生理功能是否有作用。茎环PCR、T-A克隆和Sanger测序结果显示：7个桑树源的miRNA (mno-miR166b,mno-miR166c,mno-miR167e, mno-miR396b,mno-miR156c, mno-miR398和mno-miR159a)进入了家蚕的血淋巴中,通过与对照miR169a的测序频率比较,证明了这7个桑树源miRNA不是来自大规模测序的污染,也非样品收集过程中桑叶带来的污染,是真实存在家蚕的血淋巴中。此外,克隆测序结果表明桑树源的4个miRNA(mno-miR166b,mno-miR166c,mno-miR167e和mno-miR396b)能进入家蚕的9个组织(脂肪体、丝腺、脑、卵巢、中肠、涎腺、精巢、前胸腺和马氏管)。微滴数字化PCR(ddPCR)结果表明人工合成的miR166b在被家蚕摄食后,能进入家蚕的血淋巴和脂肪体中,然而该miRNA仅能在家蚕体内持续保持约3小时便被降解。RT-PCR结果表明miR166b的11个候选靶基因在喂食人工合成miR166b前后的表达水平没有显著变化,暗示了miR166b在家蚕中没有功能或是这11个基因不是miR166b的靶基因。转录组测序的进一步分析结果表明,5龄2天的雄蚕被喂食人工合成的miR166b之后与其被喂食前相比较,全蚕的整个转录组共有30个差异表达基因,其中17个上调基因,13个下调基因。基因分类表明共有12个基因涉及免疫和响应压力,占据30个差异表达基因的40%,我们推测通过摄食进入家蚕体内的人工合成miR166b可能激发了家蚕抵抗非自我分子。6个差异表达基因(DEGs)的RT-PCR结果显示其中有3个DEGs在喂食了人工合成miR166c和／或miR167e后上调和／或下调表达,该结果暗示了转录组测序得到的12个与免疫和压力相关的DEGs表达水平变化的发生不是由于喂食的miR166b的序列引起,而是miR166b这种核酸物质造成的。表型调查表明喂食miR166b和没有喂食miR166b的家蚕在幼虫重量的增加倍数、进入熟蚕期的比率、致死率、蛹和茧壳重量等方面没有显著差异。此外,我们还预测了miR166b在30个差异表达基因中是否有作用的靶位点,结果表明没有重要的靶位点。以上结果都表明了桑树miR166b对家蚕的生理活动基本没有影响。综合上文高通量测序、克隆测序实验、ddPCR检测以及喂食人工合成miR166b的转录组分析、RT-PCR检测和表型调查的结果,我们认为桑叶中的miRNAs能通过家蚕摄食桑叶的方式进入家蚕的血淋巴和9个组织中,人工合成miR166b也能进入家蚕的血淋巴和脂肪体,然而喂食的人工合成miR166b对家蚕的生理活动没有作用。