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目的:本实验将EGF基因CDS片段亚克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1,在体外重组至腺病毒载体pAd/BL-DEST,构建重组腺病毒载体,并转染HEK293细胞进行腺病毒包装,获得重组腺病毒rAd-EGF。将重组腺病毒rAd-EGF在体外感染指数生长期人牙髓干细胞,分析人牙髓干细胞被转染后EGF蛋白的表达情况,为后续实验提供材料及数据。方法:在体外用含有10%胎牛血清的DEME培养基传代培养人牙髓干细胞至第三代,镜下观察细胞贴壁及生长情况。双酶切pCR4-TOPO-EGF及腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1,1%琼脂糖凝胶电泳检测后分别回收EGF片段的带和线状pYr-adshuttle-1载体带,连接转化感受态大肠杆菌DH5α,并进行扩增,提取重组质粒pYr-adshuttle-1-EGF,进行酶切鉴定。将鉴定正确的重组质粒采用体外同源重组将EGF表达框亚克隆至腺病毒表达载体pAd/PL-DEST,XbaI酶切重组腺病毒载体pAd-EGF,进行酶切鉴定。用PacI酶切pAd-EGF使重组腺病毒载体线性化后转染包装细胞HEK293,包装成重组腺病毒rAd-EGF,PCR鉴定并测定病毒滴度。感染前24h取指数生长期的人牙髓干细胞根据实验目的将其分为3组:重组腺病毒rAd-EGF感染组、对照腺病毒rAd-NC阴性对照组、空白对照组,当细胞密度达到70%时,感染组和阴性对照组加入100MOI重组腺病毒或对照腺病毒,空白组加等量DEME培养液,置于37℃、5%C02培养箱中培养4小时,更换培养基为含10%胎牛血清的DMEM,培养48h后胰酶消化收集各组细胞进行Western-blot,检测基因转染后各组EGF的蛋白表达差异。结果:人牙髓干细胞在镜下成梭形或多角形,2~3个不等突起,生长情况良好。 pYr-ads-1-EGF经KpnI、XhoI酶切鉴定分析表明腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1-EGF构建成功。pAd-EGF进行XbaI酶切鉴定和测序鉴定,确定和目的序列一致,腺病毒载体pAd-EGF构建成功。经PCR鉴定,重组腺病毒rAd-EGF包装成功。重组腺病毒rAd-EGF感染DPSC细胞48h后,Western-blot检测各组EGF的蛋白表达,结果显示重组腺病毒rAd-EGF感染组的EGF的蛋白表达水平均显著高于其他两对照组(p<0.05)。结论:体外成功培养人牙髓干细胞至第三代,细胞生长良好,增殖情况正常。酶切鉴定表明成功构建了重组腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1-EGF和重组腺病毒载体pAd-EGF后,采用HEK293细胞进行腺病毒包装,最终获得重组腺病毒rAd-EGF。采用重组腺病毒rAd-EGF成功转人牙髓干细胞后,高表达EGF蛋白。说明腺病毒是一种有效的转染载体,人牙髓干细胞是一种理想的基因载体细胞,腺病毒介导的EGF基因可有效转染人牙髓干细胞。