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背景肺间质纤维化（pulmonary fibrosis,PF）是由多种因素引起的一组肺间质弥漫性疾病,是异质性疾病,也是多种肺疾病的共同结局,其发病机制复杂,涉及到各种蛋白酶、胶原、免疫细胞、细胞因子、自由基损伤及细胞凋亡等因素间的相互作用。转化生长因子-β1（TGF-β1）是公认的肺间质纤维化形成和发展中的“开关性”细胞因子,作为一种多功能及强效的致纤维化因子,其在肺纤维化发生发展中的很多环节起作用,参与调控细胞的分化、增殖及细胞外基质分泌,是纤维化发生过程中最直接的一种细胞因子。因而基于TGF-β1机制的特异性抗肺纤维化治疗方法在肺纤维化治疗方面具有广阔前景,通过对TGF-β1引起肺间质纤维化的研究,为我们发展新的治疗策略提供了重要信息,提示发展药物分子靶,集中在一些与发病密切相关的靶向上（如TGFβ1）,可以作为未来治疗肺间质纤维化的重要靶点。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是新近出现的一种分子生物学技术,它通过导入由对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（double strand RNA,dsRNA）,诱导受体细胞中与其有同源序列的特异性靶mRNA降解,阻止蛋白质的翻译过程,从而使得相应的同源基因沉默。RNAi广泛存在于生物界中,从低等原核生物到植物、真菌和无脊椎动物,甚至在哺乳动物中也发现了这种现象,只是机制也就更为复杂。近年来研究发现,干扰性小RNA（small interfering RNA或short interferingRNAs,siRNA）是RNA干扰赖以发生的一种重要中间效应分子,利用小分子物质来特异性沉默基因的表达是一种有效治疗手段,很多研究正在利用这些小分子物质的特殊作用来创造出新的治疗性药物,siRNAs极大可能成为这类药物中的新成员。siRNA和RNA干扰技术的研究和应用,具有非常重要的理论和实际意义。目的根据大鼠TGF-β1mRNA序列,构建具有特异性阻断大鼠转化生长因子β1（TGF-β1）基因的TGF-β1siRNA-pSilencerTM 2.0-U6真核表达载体,并转染真核细胞（人A549肺癌细胞）,观察其在真核细胞内的表达情况,为利用基因沉默技术从转录后水平进行肺间质纤维化治疗的研究做准备。材料与方法1.应用siRNA设计软件,根据大鼠TGF-β1mRNA序列设计针对其339和1965位点的两对TGF-β1 siRNA靶序列,体外分别合成两对小发卡RNA（shorthairpin RNA,shRNA）结构的DNA序列,退火形成双链后克隆进入pSilencerTM2.0-U6表达载体,对重组体进行酶切鉴定,并送上海生物工程公司进行行序列分析。2.鉴定正确后,提取重组表达载体TGF-β1siRNA-pSilencerTM 2.0-U6,应用脂质体法转染至真核细胞（人A549肺癌细胞）,在荧光显微镜下观察其在真核细胞中表达情况。3.以空白及空质粒组(未克隆入TGF-β1 siRNA的pSilencerTM 2.0-U6质粒)做为对照,提取转染有重组表达载体TGF-β1 siRNA-pSilencerTM 2.0-U6的真核细胞内总mRNA,应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测人A549肺癌细胞中TGF-β1mRNA的表达。结果1.确定TGF-β1mRNA 339和1965位点的2个编码序列,分别为5’-GTACTTCACCAACTGCAAG-3’和5’-AAACAATGTGGTGAGT GTC-3’,根据以上靶序列体外成功设计并合成编码短发夹RNA（shRNA）序列的DNA单链。2.对重组质粒酶切鉴定,得到两端含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的位于2000bp附近的线性pSilencerTM 2.0-U6载体基因片段,和位于100bp附近的发夹样siRNA目的基因,理论与实验结果相符。3.重组质粒送生物工程公司进行T4单向测序,结果表明,克隆入真核表达载体pSilencerTM 2.0-U6的TGF-β1siRNA序列与设计完全符合。4.转染人A549肺癌细胞后实验组与对照组相比,TGF-β1siRNA能明显下调TGF-β1mRNA的表达（P＜0.01）,以339位点的TGF-β1-siRNA沉默效率最为显著（P＜0.05）,对照组TGF-β1mRNA表达水平无明显变化（P＞0.05）。结论1.根据大鼠TGF-β1mRNA序列设计出针对其的发卡样siRNA寡核苷酸片段。2.成功构建TGF-β1 siRNA-pSilencerTM 2.0-U6真核表达载体。3.通过转染细胞,成功筛选出能高效抑制TGF-β1表达的339 siRNA,为下一步利用RNAi技术干预大鼠肺间质纤维化模型形成的研究奠定了基础,有望成为临床治疗肺间质纤维化的新靶点。