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盐芥对逆境胁迫具有较强的耐受性,现已成为研究植物响应非生物胁迫应答机制的重要模式植物,是与经典模式植物拟南芥近缘的盐土植物。盐芥的全基因组测序已经完成,为科研人员提供更可靠的理论依据。miRNA是一类长度为20～24 nt的非蛋白质编码的内源单链小分子RNA,广泛存在于真核生物。植物miRNA参与调控植物自身的生长发育、代谢及免疫反应等基本过程,同时也应答多种逆境胁迫。实时定量PCR是检测植物miRNA表达模式的重要实验技术,内参基因作为最佳的标准化方法,能够消除实验材料、反应效率及操作手法等差异引起的误差。本研究筛选出用于盐芥miRNA表达分析时最适的内参基因,并对tsa-miR319的生物学功能进行初步分析。(1)选择盐芥中使用过的部分管家基因及前期Solexa测序结果显示表达稳定的miRNA作为候选的内参基因,对其在盐芥不同发育阶段的组织样本及高盐、高温、低温、干旱胁迫处理下的样本中进行表达稳定性分析,并筛选出最适的内参基因。经geNorm程序分析,tsa-miR162a、tsa-miR166a为整体处理条件下的最适内参基因,U6 snRNA、5S rRNA、tsa-miR162a、tsa-miR158为不同发育阶段组织的最适内参基因,tsa-miR162a、U6 snRNA为4种逆境胁迫条件下的最适内参基因;经NormFinder程序分析,tsa-miR162a为盐芥miRNA实时定量PCR的最佳内参基因。(2)根据生物信息学同源预测,找到tsa-miR319a、tsa-miR319b、tsa-miR3 19c的基因序列,MEME软件分析tsa-miR3 19与其他植物物种的miR319之间的保守性极高;Mfold软件分析3个前体均能折叠形成茎环结构,且在一侧臂上匹配到tsa-miR319a、tsa-miR319b、tsa-miR319c的成熟体序列。随后克隆3个前体基因,与NCBI中盐芥基因组序列进行比对,相似度为100%。利用实时定量PCR技术分析300 mmol.L-1NaCl和4℃处理下tsa-miR319的表达模式,结果显示盐胁迫处理后tsa-miR319a/b的表达整体下调,tsa-miR319c的表达呈波动变化;冷胁迫处理后tsa-miR319a/b的表达变化显著,而tsa-miR319c除在5 h表达显著下调外其余处理时间点均稳定表达。同时,tsa-miR319a/b和tsa-miR319c在不同发育阶段的各类组织中表达量存在差异,具有组织特异性及表达时序性。利用靶基因在线预测软件psRNATarget对tsa-miR319的靶基因进行预测,结合盐芥的基因功能注释分析发现预测到的35个tsa-miR319靶基因主要编码转录因子和蛋白激酶,可能参与基因表达调控及能量代谢等生物学进程。构建tsa-miR319c过表达载体,利用蘸花法遗传转化入野生型盐芥植株,获得31株具潮霉素抗性的T1代转基因盐芥幼苗。