研究背景:PLGA具有生物相容性和生物可降解,广泛用于抗癌药物递送。由PEG修饰的PLGA可以逃避免疫检测,进而增加其载药效能,并且PEG可以通过提高PLGA的渗透性和蓄积能力增加肿瘤组织对多聚物的摄取率。包裹不同抗癌药物的PLGA-PEG纳米颗粒(Nanosphere,NPs),均具有较好的物理特性和生物性能。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是胶质瘤的主要化疗药物之一,但易产生耐药性。miRNA-21是一种抗凋亡和促生存因子,在大多数实体肿瘤组织和肿瘤细胞中表达上调,与胶质瘤的进展、预后、诊断和治疗都有密切的关系,同时miRNA-21都具有调节肿瘤细胞耐药性的功能。基于NPs、miRNA-21和TMZ在胶质瘤治疗中的重要意义,我以PLGA-NPs为基础构建反义miRNA-21和替莫唑胺共递送体系。在细胞实验中,研究反义miRNA-21和替莫唑胺NPs共递送体系对胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。同时在胶质瘤移植瘤裸鼠中,直接观察miRNA-21和替莫唑胺NPs共递送体系对胶质瘤移植裸鼠的治疗效果。第一部分 共包裹反义miRNA-21和替莫唑胺的PLGA纳米微球的制备和分析目的:以PLGA纳米颗粒为基础构建miRNA-21和替莫唑胺共递送体系,并分析其物理性质。方法:采用水油乳化法分别制备空载(NP-1)、单载替莫唑胺(NP-2)、单载反义miRNA-21(NP-3)、共载有反义miRNA-21和替莫唑胺的PLGA-PEG纳米微球(NP-4)。使用zeta电位及纳米粒度分析仪测定NPs的粒径大小和zeta电位。磷钨酸染色,透射电镜下观察NPs的形态。将NPs浸泡于磷酸盐缓冲液中,观察NPs的稳定性,通过测定外部溶液中的TMZ(高效液相色谱法)和反义miRNA-21(DNA定量试剂盒)评价NPs对药物的释放。二基甲砜破坏NPs结构,高效液相色谱法检测样品中替莫唑胺水平,DNA定量试剂盒检测反义miRNA-21含量,计算NPs对反义miRNA-21和替莫唑胺的载药率和包封率。结果:1.NPs的表征分析:NPs的特征峰明显,说明合成材料为目标高聚物,尺寸范围是100～200 nm,为均匀球形,纳米颗粒之间无粘连,zeta电位均为负电位,范围是-10～-20mV。2.包封率和载药率:NP-2对TMZ的包封率和载药率分别是88.7%和0.821%,NP-3对反义miRNA-21的包封率和载药率分别是73.5%和0.043%。NP-4对替莫唑胺的包封率和载药率分别是76.9%和0.739%,对反义miRNA-21的包封率和载药率分别是67.8%和0.038%。3.稳定性:7天的浸泡中,四种NPs的粒径都在逐渐变大,但是变化幅度不大,粒径最大值均未超过300nm,说明四种NPs均较稳定。4.释放:30天的浸泡中,四种NPs逐渐释放其包裹的药物,NP-2和NP-4对替莫唑胺的第30天释放率分别是87%和83%,NP-3和NP-4对反义miRNA-21在第30天的累积释放率分别是71%和62%。结论:我们成功制备了载有TMZ和反义miRNA-21的PLGA-NPs,NPs的尺寸范围在100～200 nm之间,为均匀球形,颗粒之间无粘连,在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中较稳定,对TMZ和反义miRNA-21有较好的包封率和释放效果。第二部分共包裹反义miRNA-21和替莫唑胺的PLGA纳米微球的对胶质瘤移植细胞的影响目的:在细胞实验中,研究反义miRNA-21和替莫唑胺纳米共递送体系对普通胶质瘤细胞和耐药胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。方法:人胶质瘤细胞U251购买于南京科佰生物科技有限公司,分布诱导法培养人胶质瘤耐药细胞系U251/TZM。MTT检测不同浓度NPs(15、30、60、120和240ug/ml)和TMZ(12、24、48、96和192ug/ml)对细胞活力的影响。根据MTT检测结果分别将两种细胞分为六组,即空白对照、TMZ组(96ug/ml)、NP-1组(120ug/ml)、NP-2组(120ug/ml)、NP-3 组(120ug/ml)和 NP-4 组(120ug/ml)。流式法检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白)和耐药蛋白P-gp的相对表达水平,RT-PCR检测细胞中miRNA-21、耐药基因MGMT和MDR1 mRNA的相对表达水平。120ug/ml NP-4和胶质瘤细胞共培育24小时后,DAPI染色,镜下观察胶质瘤细胞对NP-4的摄取。结果:1.MTT毒性检测结果:各浓度的NP-1对两种胶质瘤细胞均无显著影响。120ug/ml各类纳米颗粒与96ug/ml TMZ干预下,在U251细胞中,各干预组的细胞生存率存在显著性差异,两两比较显示,TMZ、NP-2和NP-4的细胞生存率显著低于NP-1和NP-3组,NP-4的细胞生存率显著低于TMZ和NP-2组。在U251/TMZ细胞中,各干预组的细胞生存率存在显著性差异,两两比较显示,TMZ、NP-2和NP-4的细胞生存率显著低于NP-1和NP-3组,NP-4的细胞生存率显著低于TMZ和NP-2组。2.胶质瘤细胞对纳米颗粒的摄取:NP-4主要定位于细胞核,U251和U251/TMZ细胞对NP-4的摄取率分别是76%和78%。3.细胞侵袭能力和凋亡率:在U251细胞中,TMZ和NP-2使穿膜细胞数减少,细胞凋亡率增加,NP-2对穿膜细胞数和凋亡率的影响较TMZ显著。在U251/TMZ细胞中,TMZ和NP-2对穿膜细胞数和凋亡率的影响不显著。在两种细胞中,NP-3和NP-4均使穿膜细胞数减少,细胞凋亡率增加,其中NP-4对穿膜细胞数和凋亡率的影响较各组更显著。4.细胞周期:TMZ和NP-2干预后,U251细胞在M/G2期的比例增加,对U251/TMZ细胞周期无显著影响,NP-3干预后,U251细胞和U251/TMZ细胞在G0/G1期的比例均增加。NP-4干预后,U251细胞和U251/TMZ细胞在M/G2期的比例显著增加。5.凋亡相关蛋白:在U251细胞中,TMZ和NP-2使Bax蛋白升高,使Bcl-2和Caspase-3蛋白降低,NP-2对凋亡蛋白的影响较TMZ显著。在U251/TMZ细胞中,TMZ和NP-2对凋亡蛋白的影响不显著。在两种细胞中,NP-3和NP-4均使Bax蛋白升高,使Bcl-2和Caspase-3蛋白降低,其中NP-4对凋亡蛋白的影响较各组更显著。U251/TMZ细胞中Bcl-2蛋白水平显著高于U251细胞。6.miRNA-21的表达水平:miRNA-21在U251/TMZ细胞中的表达水平显著高于U251细胞。在U251/TMZ细胞中,NP-3和NP-4干预后显著降低了 miRNA-21的表达水平。7.耐药基因和蛋白:MGMT mRNA、MDR1 mRNA和P-gp蛋白在U251/TMZ细胞中的表达水平显著高于U251细胞。在U251/TMZ细胞中,NP-3和NP-4干预后显著降低了 MGMT mRNA、MDR1 mRNA和P-gp蛋白的表达水平。结论:较游离化疗药物TMZ,将TMZ包载于PLGA-PEG纳米颗粒能增加其对胶质瘤细胞的抑制作用;抑制胶质瘤细胞中miRNA-21的表达能增加细胞的侵袭能力、降低凋亡率,并能降低耐药胶质瘤细胞中耐药基因和耐药蛋白的表达;NPs共包载TMZ和反义miRNA-21后,能显著增加其对细胞活性、侵袭能力、凋亡率、凋亡相关蛋白的影响。第三部分共包裹反义miRNA-21和替莫唑胺的PLGA纳米微球的对胶质瘤细胞移植瘤裸鼠的影响目的:在胶质瘤细胞移植瘤裸鼠中,进一步研究反义miRNA-21和替莫唑胺纳米共递送体系对移植瘤裸鼠存活率和肿瘤大小的影响方法:4周龄Balb/c雄性裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,分别将U251细胞和U251/TMZ细胞注射于裸鼠背部皮下做移植瘤裸鼠。两种移植瘤裸鼠各分成6组,即空白对照组、TMZ组、NP-1组、NP-2组、NP-3组和NP-4组。NP-1组干预药物为空载NPs、NP-2组为单载TMZ的NPs、NP-3组为单载反义miRNA-21的NPs、NP-4组为载有反义miRNA-21和TMZ的NPs。干预方式是灌胃,TMZ的灌胃剂量是40mg/kg,NPs的灌胃剂量是57mg/kg。每3天干预一次,共干预6次,最后一次干预7天后,处死裸鼠。第一次干预24小时后,U251细胞移植瘤裸鼠中的TMZ组、NP-2组和NP-4组中随机抽取三只裸鼠,处死裸鼠,取出裸鼠的肝脏、大脑、肾脏和肿瘤组织,DAPI染色,显微镜成像观察TMZ在各组织的分布。TUNEL法检测胶质瘤组织细胞凋亡情况。Western blot检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白)和耐药蛋白P-gp的相对表达水平,RT-PCR检测肿瘤组织中miRNA-21、耐药基因MGMT和MDR1 mRNA的相对表达水平。结果:1.各组裸鼠死亡率:在U251移植瘤裸鼠中,空白对照组和NP-1组的死亡率最高均为50%,NP-3组次之为25%,TMZ组的死亡率为12.5%,NP-2组和NP4组均无裸鼠死亡。在U251/TMZ移植瘤裸鼠中,空白对照组的死亡率最高为62.5%;TMZ组和NP-1组的死亡率第二,均为50%;NP-2和NP-3组的死亡率第三,为37.5%;NP4组的死亡率最低,为12.5%。2.肿瘤体积:在U251细胞移植瘤裸鼠中,TMZ和NP-2干预能显著减小肿瘤体积,NP-2对肿瘤体积的影响较TMZ显著。在U251/TMZ细胞移植瘤裸鼠中,TMZ和NP-2对凋亡蛋白的影响不显著。在两种裸鼠中,NP-3和NP-4均显著减小肿瘤体积,其中NP-4对肿瘤体积的影响较各组更显著。3.TMZ在U251移植瘤裸鼠各器官的分布:以游离TMZ干预裸鼠后,TMZ主要分布在肝、肾和脑组织,肿瘤组织的药物较少。但是NP-2和NP-4干预U251移植瘤裸鼠后,药物在肿瘤组织的蓄积量显著增加,在肝、肾和脑组织的蓄积量减少。4.肿瘤组织细胞凋亡率和凋亡相关蛋白:在U251移植瘤裸鼠中,TMZ和NP-2使肿瘤组织细胞凋亡率升高、使Bax蛋白升高,使Bcl-2和Caspase-3蛋白降低,NP-2对凋亡率和凋亡蛋白的影响较TMZ显著。在U251/TMZ移植瘤裸鼠中,TMZ和NP-2对凋亡蛋白的影响不显著。在两种裸鼠中,NP-3和NP-4均使肿瘤组织细胞凋亡率升高,使Bax蛋白升高,使Bcl-2和Caspase-3蛋白降低,其中NP-4对凋亡率和凋亡蛋白的影响较各组更显著。U251/TMZ移植瘤裸鼠中Bcl-2蛋白和Caspase-3蛋白水平显著高于U251移植瘤裸鼠,Bax蛋白水平显著低于U251移植瘤裸鼠。5.miRNA-21的表达水平:miRNA-21在U251/TMZ移植瘤裸鼠中的表达水平显著高于U251移植瘤裸鼠。在U251/TMZ移植瘤裸鼠中,NP-3和NP-4干预后显著降低了 miRNA-21的表达水平。6.耐药基因和蛋白:MGMT mRNA、MDR1 mRNA和P-gp蛋白在U251/TMZ移植瘤裸鼠中的表达水平显著高于U251移植瘤裸鼠。在U251/TMZ移植瘤裸鼠中,NP-3和NP-4干预后显著降低了 MGMT mRNA、MDR1 mRNA和P-gp蛋白的表达水平。结论:较游离化疗药物TMZ,将TMZ包载于NPs能增加其抑瘤率,并增加TMZ在肿瘤组织的分布,降低其在非肿瘤组织的分别;载有反义miRNA-21的NPs能减少移植瘤裸鼠的肿瘤体积、促进肿瘤组织的细胞凋亡、并能降低U251/TMZ移植瘤裸鼠中耐药基因MGMT和MDR1、耐药蛋白P-gp的表达;NPs共包载TMZ和反义miRNA-21后,能显著降低移植瘤裸鼠的死亡率,抑制肿瘤生长,促进肿瘤组织中细胞凋亡,并逆转U251/TMZ移植瘤裸鼠的耐药性。