研究背景和目的肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是肝癌中最常见的类型,占所有原位肝癌病例的90%以上。研究表明,慢性炎性反应与肝癌的发生发展密切相关。我国肝癌患者大多伴有长期慢性病毒感染及大量免疫细胞侵润,因此肿瘤不同部位免疫微环境与肿瘤的发生发展密切相关。巨噬细胞具有高度的可塑性,不同的环境因素刺激呈现不同的表型。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是肿瘤组织中浸润的巨噬细胞,是肿瘤微环境中侵润的炎性细胞的最主要成分。研究表明肿瘤细胞通过分泌细胞因子、趋化因子等(如CSF1、MCP-1)从外周血中募集单核细胞到达肿瘤局部,诱导分化形成TAMs。TAMs的活化类似于巨噬细胞的选择性激活(alternative activation,M2-like)。临床样本分析发现,多种肿瘤组织中‘TAMs的密度与肿瘤预后密切相关,如肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等。进一步研究认为：TAMs在肿瘤细胞的增殖、存活、浸润和转移中起重要作用。但是也有研究指出,肿瘤癌旁组织中巨噬细胞呈现类似经典激活的表型(classical activation, M1-like),并通过促进血管新生等机制促进肿瘤发展。目前,巨噬细胞作为肿瘤间质的重要组成部分,其对肿瘤局部微环境调节的分子机制逐渐成为研究的热点。信号调节蛋白α(SIRPα)是一类广泛表达的糖蛋白分子,属于免疫球蛋白超家族结构域。SIRPα在免疫细胞中特异表达在巨噬细胞和树突状细胞等髓系细胞表面。SIRPα的胞内段含有富含酪氨酸的免疫抑制性基序(ITIMs),在多种刺激下发生磷酸化并与下游分子SHP1/SHP2结合,调节信号的强度和持续时间。研究表明SIRPα参与维持小鼠T细胞与NK细胞的稳态,我们实验室先前发现SIRPα负性调节Toll受体介导的巨噬细胞固有免疫,提示SIRPα参与了机体免疫系统的发育与免疫细胞的活化。目前关于SIRPα在巨噬细胞介导的肿瘤免疫中的作用机制尚未见报道。我们发现单核/巨噬细胞SIRPα的表达水平在肝癌患者与正常人外周血中无明显差异,但在肝癌癌旁组织中表达明显降低,而在肝癌癌巢组织中呈现一定水平的恢复。体外研究表明肝癌细胞诱导巨噬细胞SIRPα的表达水平明显下调。以上结果提示SIRPα对肿瘤微环境诱导的巨噬细胞激活可能存在调节作用。为了解SIRPα在巨噬细胞肿瘤免疫中的作用和机制,本课题通过siRNA转染或慢病毒感染干扰小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)中SIRPα的表达,利用共培养研究体系,探讨了SIRPα对肝癌细胞诱导的巨噬细胞活化的影响,全面探讨了SIRPα对巨噬细胞表型、迁移和存活的调节,并探讨SIRPα对肿瘤诱导的巨噬细胞PI3K-Akt和NF-κB等信号通路活化的影响。为进一步探讨SIRPα对肿瘤进程的调节,本课题通过小鼠体内回输差异表达SIRPα的巨噬细胞,利用不同的小鼠荷瘤模型,研究巨噬细胞SIRPα对肿瘤体内生长的影响,并进一步探讨SIRPα发挥上述作用的可能机制,确定了SIRPα在肿瘤微环境中巨噬细胞功能调节中的重要地位,为肿瘤的治疗提供新策略和新思路。实验方法：1.收集临床肝癌患者新鲜肿瘤与癌旁组织样本以及肝癌患者与正常健康人的外周血样本,通过消化与密度梯度离心方法分离获得单核／巨噬细胞,利用流式细胞检测单核/巨噬细胞中SIRPα的表达。结合患者临床资料,统计分析肿瘤组织巨噬细胞SIRPα的表达、癌旁组织巨噬细胞SIRPα的表达、肿瘤/癌旁组织巨噬细胞SIRPα的表达与肿瘤临床资料的相关性。2.C57BL/6来源的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6皮下接种同系小鼠,成瘤后分离小鼠外周血及肿瘤组织中单核／巨噬细胞,检测SIRPα的表达；Balb/c来源的小鼠肝癌细胞H22腹腔接种同系小鼠,待成瘤后检测外周血及腹水中单核／巨噬细胞SIRPα的表达。3.诱导培养小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs),利用transwell共培养体系(0.4胛),检测肝癌细胞对巨噬细胞SIRPα表达的调节及巨噬细胞活化标志(MHCⅡ、细胞因子表达)等;通过H202、缺氧等各种刺激模拟肿瘤微环境,检测巨噬细胞SIRPα的表达。4.合成并鉴定具有特异干扰效果的siRNA或包装慢病毒,干扰巨噬细胞SIRPα、 SHP2的表达。5.利用transwell共培养体系(0.4μm),采用ELISA,Real-time PCR等方法检测差异表达SIRPα的巨噬细胞在肿瘤细胞刺激下细胞因子(如TNFα、IL6、IL10、IL12等)表达和分泌的变化。6.运用特异磷酸化抗体检测SIRPα对巨噬细胞Stat3、NF-κB、PI3K-Akt等信号通路活化的作用;利用荧光素酶报告基因系统检测NF-κB和iNOS的转录活性。7.利用transwell迁移体系(5.0μm),检测差异表达SIRPα的巨噬细胞向肿瘤细胞迁移能力的差别；利用CMFDA标记巨噬细胞体内检测SIRPα对巨噬细胞迁移至肿瘤组织的能力的影响。8.检测SIRPα表达对MCP-1、CSF1诱导的巨噬细胞迁移能力的调节；利用特异性磷酸化抗体检测PLCγ、Rac等迁移相关信号分子的活化。9.利用TNFα+CHX、TRAIL等刺激模拟肿瘤微环境中存在的促凋亡因子诱导巨噬细胞发生凋亡,检测SIRPα对巨噬细在不利刺激下凋亡水平的调节。10.采用清除体内巨噬细胞再静脉输入巨噬细胞的方法获得体内具有不同SIRPα表达水平的巨噬细胞的C57BL/6小鼠,将C57L来源的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6通过皮下荷瘤或原位荷瘤等方法接种小鼠,观察肿瘤的体内生长差异；采用同样的方法获得具有不同SIRPα表达水平的巨噬细胞的Balb/c小鼠,将Balb/c来源的H22细胞通过腹腔注射的方法接种小鼠,观察肿瘤的生长差异,记录不同组小鼠的荷瘤生存时间。11.检测差异表达SIRPα的巨噬细胞对肿瘤微环境的调节：收集上述小鼠的Hepa1-6肿瘤样本,通过Real-time PCR等方法检测肿瘤组织中炎性因子(TNFα、IL6、 VEGF等)的表达水平；收集H22荷瘤小鼠的腹水,ELISA检测腹水中炎性因子的分泌水平。12.采用免疫组化的方法检测具有不同SIRPα表达水平的巨噬细胞的小鼠肿瘤样本中血管新生的差异；通过Western-blot和荧光素酶报告基因系统检测SIRPα对巨噬细胞介导的血管新生相关信号通路HIF1α-NFAT-COX2-VEGF的调节。13.采用免疫共沉淀的方法确定SIRPα与SHP2的相互作用及与SHP2相互作用的蛋白。14.采用瞬时干扰SHP2后检测其对肿瘤诱导的巨噬细胞释放细胞因子和信号通路磷酸化的调节,确定SHP2在巨噬细胞活化中的作用。15.采用免疫共沉淀的方法检测SIRPα的不同表达是否影响SHP2与下游相互作用蛋白的结合。实验结果：1. SIRPα在肿瘤患者中的表达：单核/巨噬细胞SIRPα的表达水平在肝癌患者与正常人外周血中无明显差异,但在肝癌癌旁组织中表达明显降低,而在肝癌癌巢组织中呈现一定水平的恢复。体外研究表明肝癌细胞诱导巨噬细胞SIRPα的表达水平明显下调。2. SIRPα在小鼠肝癌荷瘤样本中的表达：与正常小鼠相比,荷瘤小鼠外周血单核／巨噬细胞SIRPα的表达无明显差异；Hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤组织及H22肿瘤腹水中巨噬细胞SIRPα的表达明显低于相应的小鼠外周血单核细胞。3.肿瘤细胞诱导巨噬细胞SIRPα表达下调：与正常培养及小鼠原代肝细胞共培样的巨噬细胞相比,肿瘤细胞诱导巨噬细胞SIRPα表达早期快速下调,并伴随着巨噬细胞的活化(MHCⅡ表达升高、细胞因子释放);与肿瘤细胞共培养较长时间(5天)后,巨噬细胞SIRPα表达恢复,并伴随巨噬细胞免疫抑制表型(MHCⅡ表达下降、细胞因子释放减少)。4.肿瘤微环境中的因子参与诱导巨噬细胞SIRPα的下调：肿瘤微环境中的炎性因子如TNFα缺氧、高ROS水平(H202)等刺激能诱导巨噬细胞SIRPα表达的下调;利用特异性中和TNFα的抗体能部分抑制肿瘤细胞诱导的巨噬细胞SIRPα表达的下调。5.肿瘤微环境引起巨噬细胞SIRPα表达下调的机制：巨噬细胞与肿瘤细胞共培养不同的时间点,Real-time PCR检测巨噬细胞SIRPα的表达水平,发现肿瘤微环境可以诱导巨噬细胞SIRPα转录水平的下降。利用不同的蛋白酶体和溶酶体抑制剂处理巨噬细胞后发现肿瘤诱导的巨噬细胞SIRPα蛋白水平的下调部分通过溶酶体介导的蛋白降解途径参与。6. SIRPα调节巨噬细胞在肿瘤微环境中的表型：细胞因子、信号分子检测的结果表明,SIRPα抑制肿瘤诱导的巨噬细胞炎性因子‘TNFα、IL6的释放和免疫抑制因子IL10的表达；进一步研究表明SIRPα抑制巨噬细胞Argl的表达,促进NOS2的表达；此外,SIRPα抑制肿瘤诱导的巨噬细胞NF-κB和Stat3的活化,促进Statl的磷酸化。7. SIRPα调节巨噬细胞向肿瘤细胞迁移：体内外实验表明SIRPα显著抑制巨噬细胞向肿瘤细胞的迁移;此外SIRPα显著抑制MCP-1、CSF1诱导的巨噬细胞迁移及相应信号分子PLCγ和Rac的活化。8. SIRPα调节巨噬细胞在肿瘤微环境中的存活：低表达SIRPα的巨噬细胞在促凋亡信号刺激下的细胞凋亡水平明显受到抑制;SIRPα抑制细胞存活相关信号PI3K-Akt的活化。9.巨噬细胞SIRPα的表达对肿瘤生长的影响：采用清除体内巨噬细胞再静脉输入巨噬细胞的方法获得体内具有不同SIRPα表达水平的巨噬细胞的C57BL/6小鼠,将C57L来源的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6通过皮下荷瘤或原位荷瘤等方法接种小鼠,发现干扰SIRPα表达的巨噬细胞显著促进肿瘤的体内生长;采用同样的方法获得具有不同SIRPα表达水平的巨噬细胞的Balb/c小鼠,将Balb/c来源的H22细胞通过腹腔注射的方法接种小鼠,发现干扰SIRPα表达的巨噬细胞明显缩短了小鼠的生存时间。10.巨噬细胞SIRPα的表达对肿瘤微环境的重构的调节：通过Real-time PCR和ELISA方法检测发现低表达SIRPα的巨噬细胞促进肿瘤微环境中炎性因子的表达。此外,低表达SIRPα的巨噬细胞促进肿瘤细胞的增殖和Stat3及NF-κB信号通路的活化。11.巨噬细胞SIRPα的表达对肿瘤血管新生的调节：免疫组化染色发现低表达SIRPα的巨噬细胞促进肿瘤血管新生；进一步研究显示肿瘤微环境中低表达SIRPα的巨噬细胞其血管新生相关通路HIF1α-NFAT-COX2-VEGF明显增强。12. SIRPα调节肿瘤微环境中巨噬细胞功能的机制：肿瘤细胞刺激巨噬细胞后可以发现SIRPα发生磷酸化,SIRPα磷酸化后可与SHP2和PI3K激酶调节亚基PI3Kp85结合；瞬时干扰SHP2表达后可见SHP2正性调节肿瘤诱导的巨噬细胞NF-κB和PI3K-Akt信号通路活化及相应炎性因子的表达；进一步研究表明SIRPα对巨噬细胞的调节作用部分通过SHP2发挥作用的,SIRPα低表达显著提高SHP2与IKKβ的结合,促进IKK复合物的活化和NF-κB信号通路的激活；进一步研究发现SIRPα低表达显著增强SHP2与PI3Kp85的结合,增强PI3K催化亚基PBKp110的活性。所以SIRPα可能通过竞争性抑制SHP2与IKKs和PI3Kp85亚基的结合,抑制巨噬细胞NF-κB和PI3K-Akt信号通路活化。结论：本研究从分子-细胞-动物-临床水平全面深入研究了信号调节蛋白α对肿瘤相关巨噬细胞功能的调节作用和分子机制。本课题研究发现肿瘤细胞通过分泌可溶性因子等方式诱导巨噬细胞SIRPα表达下调,促进巨噬细胞迁移至肿瘤局部并增强其在肿瘤微环境中存活的能力；低表达SIRPα的巨噬细胞在肿瘤微环境中分泌炎性因子及血管新生因子的能力显著增强,参与促肿瘤微环境的重构,进而促进肿瘤的发展,形成正反馈调节通路。因此,肿瘤细胞诱导的巨噬细胞SIRPα表达下调可能是肿瘤促进自身发生发展的重要途径。本课题还深入讨论了SIRPα调节巨噬细胞相关信号通路的作用机制,证明其可能通过竞争抑制SHP2与IKKs复合物和PI3K复合物相结合发挥调控作用。研究背景及目的目前过敏性疾病的发病率显著上升,Ⅰ型超敏反应就是其中一种重要的类型。Ⅰ型超敏反应发病突然,迅速引起机体损伤,严重时可能威胁生命。能够致敏的抗原性物质在自然界广泛存在,可以经呼吸道消化道或皮肤接触等途径进入体内,刺激机体免疫系统产生抗原特异性免疫球蛋白E(IgE)。IgE分子可以与效应细胞表面受体FcεRI稳定结合,当特异抗原再次进入体内,可以同IgE分子结合并且使相邻的FcεRI交联,引起细胞活化。FcεRI是由α链、p链和两条γ链组成的四聚体。FcεRI α链含有配体结合链,IgE的Fc段结合后,募集激活β链和γ链的ITAM区,使ITAM发生磷酸化并介导下游信号传递。肥大细胞是Ⅰ型超敏反应的重要效应细胞,主要通过脱颗粒和分泌炎性因子等发挥其生物学作用。免疫细胞的激活及免疫反应的强度和范围受到多种机制调节,目前认为,免疫反应正性和负性信号的平衡是维持机体免疫稳态的主要方式。免疫反应的负性信号就包括抑制性受体介导的信号调控。信号调节蛋白家族(SIRP)就是一类细胞表面的抑制性受体。信号调节蛋白α(signal regulatory protein α,SIRPα)属于免疫球蛋白受体超家族,SIRPα主要表达在神经元细胞及髓系来源细胞,如肥大细胞。SIRPα胞外区具有三个IgSF样结构域和多个糖基化位点,胞内区带有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIMs),能够发生磷酸化并募集信号分子,目前研究表明,SIRPα的下游分子主要包括SHP-1和SHP-2。SIRPα对肥大细胞功能的调节尚未见系统性报道。我们研究发现IgE-DNP介导的肥大细胞激活后SIRPα表达水平下降,提示SIRPα对肥大细胞活化可能存在抑制作用。为进一步了解SIRPα在肥大细胞活化过程中的作用,本课题通过通过差异表达SIRPα的肥大细胞研究了SIRPα在抗原诱导肥大细胞活化中的作用。实验方法：1.分离培养小鼠骨髓来源肥大细胞(BMMCs),合成鉴定具有特异干扰SIRPα表达的siRNA,瞬时干扰BMMCs SIRPα的表达；利用大鼠肥大细胞系RBL-2H3,建立稳定高表达Myc-SIRPα和转染空载体对照的细胞系；2.检测肥大细胞活化后p-氨基己糖胺酶的释放,研究体外SIRPα对肥大细胞脱颗粒的调节；3.利用肥大细胞缺失小鼠(c-kitwsh/wsh),重构肥大细胞系统,进行被动皮肤过敏反应,体内观察SIRPα对肥大细胞脱颗粒的调节；4.肥大细胞脱颗粒与细胞骨架重排密切相关,采用荧光探针检测SIRPα对细胞骨架F-actin聚合的调节；检测SIRPα对细胞微管形成的影响；5.细胞骨架重排与胞内钙离子流动有关,使用Ca2+指示剂检测SIRPα对抗原引起肥大活化过程中Ca2+流动的调节；6.检测SIRPα对肥大细胞活化后细胞因子表达分泌的调节；7.检测SIRPα对肥大细胞活化MAPK、NFAT等信号通路的调节;8.检测SIRPα调节肥大细胞活化的分子机制。结果1. SIRPα参与抗原诱导的肥大细胞活化过程：肥大细胞活化过程中SIRPα表达降低,并呈现抗原剂量与时间依赖性。SIRPα发生磷酸化并募集SHP-1和SHP-2。2. SIRPα调节肥大细胞活化后脱颗粒：SIRPα显著抑制体外肥大细胞脱颗粒和体内PCA反应引起的血管渗出；3. SIRPα抑制肥大细胞活化过程中的细胞骨架改变：SIRPα抑制肥大细胞活化过程中tubulin聚合及F-actin解聚;4. SIRPα抑制肥大细胞Ca2+释放,提示SIRPα能够通过调节Ca2+释放影响肥大细胞骨架改变及脱颗粒过程；此外SIRPα明显抑制Rac-1GTPase的活性,进而抑制了微管的形成。5. SIRPα抑制肥大细胞细胞因子合成分泌：抗原诱导的肥大细胞活化过程中,SIRPα通过抑制MAPK信号通路磷酸化以及转录因子NFκB和NFAT活性,抑制肥大细胞由抗原诱导的炎性因子合成与分泌。6. SIRPα在抗原诱导的肥大细胞活化过程中发挥负性调节作用的机制：肥大细胞活化引起SIRPα发生磷酸化。随后SIRPα通过竞争结合SHP-2,影响SHP-2与PI3Kp85及IKKβ的结合,抑制Akt与NF-κB信号通路。结论本研究从分子—细胞—动物水平较深入研究了信号调节蛋白SIRPα对肥大细胞功能的调节作用,发现SIRPα负性调节肥大细胞活化,包括抑制肥大细胞脱颗粒及炎性因子合成。同时本研究进一步探讨了SIRPα调节相关信号转导通路的作用机制,证明SIRPα可能通过抑制SHP-2与IKKβ及PI3Kp85的结合发挥负向调控作用。