磷脂酶是水解甘油磷脂的一类酶,有磷脂酶A1、A2、B、C和D等亚型。其中,磷脂酶A1能够特异性水解天然磷脂Sn-1位酰基,得到L-p溶血磷脂。主要用途是生产溶血磷脂、大豆油脱胶、加工卵黄、奶酪及甘油二酯的制备等。尤其在植物油脱胶方面,磷脂酶A1的高效率、低能耗、低污染的优点受到广泛的关注,研究及应用。虽然磷脂酶A1来源广泛,但其纯酶的获得较少,离工业化生产的要求还相差很远,所以大量生产并纯化磷脂酶A1是必要的。如今,基因工程技术的快速发展,使得磷脂酶A1在微生物表达系统的表达成为现实,但单独表达磷脂酶Al时,可溶性表达量低。因此,本实验将来源于粘质沙雷氏菌的磷脂酶A1基因克隆到带有不同标签的质粒上,并进行了融合蛋白的表达及纯化。本文主要进行了以下几个方面的研究：(1)根据GenBank中plaA基因序列(D:JX138535)和质粒载体,设计特异性引物,以重组质粒AP28为模板,PCR扩增获得plaA基因。分别构建了重组质粒pGEX-4T-2-A,His-GST-A以及pMAL-c2x-A,对重组质粒进行酶切及测序鉴定,结果表明,融合标签基因和目的基因plaA在同一阅读框,说明成功构建了三种带有不同标签的重组表达质粒。(2)将重组质粒pGEX-4T-2-A,His-GST-A以及pMAL-c2x-A,转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中,37℃下,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果检测表明：三种不同的融合蛋白GST-A, His-GST-A, MBP-A都正确表达,但均以包涵体形式表达,未检测到可溶性蛋白的表达。通过降低诱导温度和IPTG浓度,更换培养基和宿主菌,以及更换载体等方法来促进融合蛋白的可溶性表达,但仍未检出可溶性蛋白。通过对粘质沙雷氏菌的磷脂酶A1蛋白序列分析发现：在其氨基酸全序列中的177-202处是一段疏水性较强的一个肽段,这可能是导致融合蛋白形成包涵体沉淀,而无法得到可溶性蛋白的原因。(3)对表达菌株BL21/His-GST-A进行表达条件优化,得到摇瓶培养最佳条件为：IPTG加量0.2 mmol/L,温度为37℃, OD600nm值为0.5,诱导时间6 h。在此条件下,利用尿素对包涵体进行变复性,然后对复性液进行纯化,对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测,并通过Bradford法对纯化后的蛋白浓度进行测定。最后,又对纯蛋白进行酶活测定以及酶学性质进行研究。结果表明：纯化后的His-GST-A蛋白SDS-PAGE检测为单一条带,蛋白浓度达到293.59μg/mL。对其酶学性质进行研究发现,在最适缓冲液pH5.5和最适温度35℃条件下,酶活为27.6U/mL,比酶活为94U/mg。(4)通过比较复性纯化后His-GST-A 和 His-A蛋白的比酶活,明确了GST蛋白标签的存在会影响磷脂酶A1酶活,使酶活降低。并且得到约2.53mg的His-A蛋白冻干样品。总之,本文通过利用不同标签,对磷脂酶A1进行可溶性表达,但结果均以包涵体形式表达。然后,对融合蛋白His-GST-A和His-A进行包涵体变复性纯化得到了纯酶,比较了GST标签蛋白对磷脂酶A1蛋白酶活的影响。最后,得到了His-A蛋白冻干样品,为磷脂酶A1的进一步研究奠定基础。