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背景和目的:肝纤维化(hepatic fibrosis)是多种慢性肝病的共同病理基础,是临床向肝硬化发展的必经环节。目前的研究认为肝纤维化属于可逆性病变。肝纤维化是由于肝损伤持续存在,组织发生修复时,细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)合成和降解失衡而引起的病理改变。过度沉积的ECM不仅是由于合成增多,更大程度是由于后期降解减少引起。它涉及复杂的细胞和分子机制的动态过程。其中起主导作用的是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)-金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMPs)系统。其中,间质胶原酶MMP-1(人)/MMP-13(鼠)主要降解Ⅰ、Ⅲ型胶原,TIMP-1可广泛抑制MMPs的活性。在正常肝脏,二者维持着动态平衡的状态,在各种致病因素的作用下,导致二者作用失衡,引起以胶原为主的ECM降解减少,沉积于肝脏,引发肝纤维化。肝纤维化的必经环节是肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)的激活,转变成为肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)。MFB随着肝纤维化进展最终转变成为纤维细胞,这个过程中将分泌大量的ECM。HSC在体外培养可以自行活化,模拟了体内肝纤维化的过程,是很好的肝纤维化模型。HSC活化后合成和分泌大量的ECM和TIMP-1,后者抑制了MMPs的活性,减少了ECM的降解,促进了肝纤维化的进展。由于HSC所处的核心地位,HSC成为了国内外学者研究的热点。本研究旨在分离和培养大鼠HSC,以脂质体包埋反义TIMP-1表达质粒和pcDNA3.1(+)质粒,导入体外培养的大鼠HSC,并筛选阳性细胞,通过免疫组化检测TIMP-1、MMP-13蛋白的表达,纤维细胞计数,RIA法检测透明质酸(HA),Ⅲ型前胶原氨端肽(PⅢNP)表达的改变。探讨基因治疗肝纤维化的可行性和有效性,为今后肝纤维化的基因治疗提供理论基础。材料和方法:1、大鼠HSC的分离和培养:健康Wistar大鼠,麻醉后原位以HBSS冲洗肝脏,接着以胶原酶、链霉蛋白酶灌注,分离肝脏,剪碎,消化,过滤,密度梯度离心,得到HSC。Desmin免疫组化染色鉴定;2、G418最佳筛选浓度的确定:将G418配制成0-600ug/ml的液体,加至未转染的细胞,培养11d,以7-10d 90%细胞致死剂量为最佳筛选浓度,故确定450ug/ml为大鼠HSC最佳筛选浓度,维持量为200ug/ml;3、Lipofectamine 2000脂质体转染并筛选HSC : Lipofectamine 2000脂质体包埋反义TIMP-1/pcDNA3.1(+)表达质粒和pcDNA3.1(+)质粒,转染HSC,48h后,以确定的G418最佳筛选浓度450ug/ml筛选,培养18天后,获得阳性克隆,挑选阳性克隆培养;4、结果观察:免疫组化检测TIMP-1、MMP-13蛋白的表达,并应用计算机图像分析技术半定量检