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背景和目的:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）作为儿童及青少年中最致命的原发性骨恶性肿瘤之一,其主要致命原因在于疾病的早期易于发生肺部的微转移。传统的手术及放化疗治疗方案对于无转移患者的五年生存率有着非常显著的提升（55-80%）。然而,近几十年来,因骨肉瘤具有高复发率,对化疗药物多重耐药性以及早期肺转移等特点,骨肉瘤患者的预后并没有得到显著的提升。因此,寻找骨肉瘤相关的新型分子标志物以及治疗靶点便显得迫在眉睫。Aurora-B作为原癌基因在多种恶性肿瘤中高表达,并与肿瘤的发生发展密切相关。我们前期研究发现,Aurora-B在骨肉瘤组织中高表达,与肺部转移正相关。但是,其在骨肉瘤肺转移过程中所发挥的潜在作用及具体细胞和分子学机制尚不清楚。自噬作为一把双刃剑在肿瘤的转移过程中发挥着重要的作用,然而,Aurora-B在骨肉瘤中对自噬及肺转移的作用及其机制未见报道。本研究旨在进一步阐明Aurora-B在骨肉瘤中对骨肉瘤转移的作用及可能调控机制,为临床骨肉瘤的防治提供新的策略和干预手段。方法:1、Aurora-B在肿瘤组织中表达分布与骨肉瘤患者生存预后及自噬相关蛋白表达关系:使用GEPIA数据库,分析包括肉瘤在内的不同肿瘤组织中Aurora-B基因的表达分布情况。获取数据库中肉瘤患者生存预后情况,分析Aurora-B基因表达与肉瘤患者生存预后的关系。临床收集69例骨肉瘤患者瘤体组织,使用免疫组化染色法检测Aurora-B及自噬相关蛋白表达分布关系,结合患者住院信息及出院后随访情况,分析Aurora-B表达与骨肉瘤患者瘤体大小、转移、病理分期及预后之间的关系。2、敲低Aurora-B对骨肉瘤细胞自噬及侵袭转移的影响:使用干扰慢病毒载体（LV-sh RNA）敲低骨肉瘤细胞系Aurora-B蛋白表达,利用LC3双标荧光法及透射电镜观察骨肉瘤细胞系自噬小体的形成,Western blot检测自噬相关蛋白及自噬流的形成。利用Transwell侵袭迁移实验、Wound healing划痕实验,检测骨肉瘤细胞侵袭迁移能力,Western blot检测金属基质蛋白酶,探究骨肉瘤细胞迁移能力的相关分子机制。氯喹阻断激活的自噬,进一步检测敲低Aurora-B诱导的自噬在骨肉瘤侵袭迁移中的作用。3、敲低Aurora-B通过抑制mTOR信号通路激活的自噬对骨肉瘤细胞侵袭迁移的作用:Western blot检测mTOR通路相关蛋白表达,利用mTOR激活剂进一步检测Aurora-B敲低对自噬的影响。Transwell侵袭迁移实验、Wound healing划痕实验,检测骨肉瘤细胞侵袭迁移能力。使用mTOR激活剂重新激活mTOR信号通路,进一步探究mTOR信号通路在骨肉瘤自噬及侵袭迁移中的作用。4、敲低Aurora-B介导的自噬在体内对骨肉瘤肺转移的影响:使用裸鼠原位成瘤法构建骨肉瘤原位裸鼠模型,将裸鼠模型分为4:对照组、AZD2811组、AZD2811+3BDO组、AZD2811+CQ组。解剖收集原位瘤体组织,利用免疫组化技术检测各组瘤体内Aurora-B及磷酸化mTOR的表达分布情况,收集肺部组织,利用小动物活体成像技术、HE染色、体式显微镜等观察原位裸鼠肺转移情况。结果:1、通过GEPIA数据库分析31种不同肿瘤组织中Aurora-B蛋白表达发现,相比于对应的癌旁组织,Aurora-B在大部分肿瘤组织中高表达,其中相对高表达的肿瘤有29种。单独分析Aurora-B在肉瘤组织及相应癌旁组织中的表达发现,Aurora-B在肉瘤组织中的表达显著高于癌旁组织（P<0.05）。数据库262例肉瘤患者中,通过Kaplan-Meier分析发现,Aurora-B表达与肉瘤患者生存预后显著相关,其中Aurora-B的高表达预示着患者更差的总体生存率（P=0.0041）和无病生存率（P=0.00078）。在69例骨肉瘤患者瘤体组织中,Aurora-B表达与骨肉瘤患者Enneking分期（P=0.031）、自噬相关蛋白LC3B表达（P=0.016）呈负相关。Kaplan-Meier分析发现,Aurora-B蛋白的高表达与患者总体生存率（P=0.0022）及无转移生存率（P=0.0107）负相关。2、利用干扰慢病毒成功敲减骨肉瘤细胞系Aurora-B蛋白及m RNA表达。LC3双标荧光及透射电镜观察发现,敲低骨肉瘤细胞Aurora-B蛋白表达,细胞内自噬小体及自噬溶酶体显著增加。Western blot分析发现,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比例增加,同时P62的表达显著减少,抑制Aurora-B蛋白的表达显著增加了肿瘤细胞内自噬流的形成。为了探究Aurora-B敲低所诱导的自噬在骨肉瘤细胞系中对侵袭迁移的影响,利用Transwell侵袭迁移实验、Wound healing划痕实验发现,敲低Aurora-B蛋白的表达显著降低了骨肉瘤细胞侵袭迁移能力,使用CQ阻断激活的自噬能够显著逆转骨肉瘤细胞被抑制的迁移和侵袭能力,Western blot分析发现,骨肉瘤细胞内Aurora-B蛋白的敲低显著抑制了MMP2蛋白的表达,而CQ的使用能够显著恢复MMP2的表达。3、Western blot分析发现,Aurora-B的敲低显著抑制mTOR信号通路相关蛋白表达,mTOR激动剂的应用能够显著回复mTOR的磷酸化及自噬相关蛋白P62的表达。为了进一步探究mTOR在骨肉瘤细胞系对自噬及侵袭迁移的影响,利用Transwell侵袭迁移实验、Wound healing划痕实验发现,mTOR的重新激活显著逆转了Aurora-B敲低对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的抑制。4、裸鼠荷瘤实验表明,Aurora-B特异性抑制剂AZD2811的应用成功抑制了骨肉瘤裸鼠体内Aurora-B蛋白的表达,同时p-mTOR表达显著减低。联合应用AZD2811和mTOR激动剂3BDO对裸鼠模型进行回复实验发现,3BDO的应用重新激活了mTOR的活性。利用小动物活体成像技术、HE染色、体式显微镜等观察原位裸鼠肺转移灶发现,AZD2811的使用有效降低了骨肉瘤裸鼠模型肺转移灶数量。联合应用AZD2811和3BDO或自噬抑制剂CQ治疗,有效回复了因Aurora-B抑制所减少的肺转移灶数量。结论:Aurora-B在包括肉瘤在内的多种肿瘤中表达异常升高,且与骨肉瘤患者总体生存率、自噬相关蛋白表达、Enneking分期、远处转移等密切相关。敲低骨肉瘤细胞Aurora-B蛋白表达能够通过mTOR信号通路激活细胞自噬并抑制骨肉瘤的肺转移能力。