共载阿霉素和依克立达的PLGA/TPGS纳米粒抗肝癌细胞和肝癌干细胞的作用研究

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肝癌是最常见的肿瘤之一,严重威胁人类的健康。目前,对于肝癌的治疗依旧以传统的治疗手段为主,但治疗效果不佳。肝癌干细胞(Liver Cancer Stem Cells,LCSCs)是肿瘤细胞中正常干细胞具有类似功能的一种细胞亚群,具有自我更新、无限增殖的能力,被认为是肿瘤易复发的主要原因。因此,增强药物对肝癌干细胞的靶向杀伤能力对提高肿瘤的治疗效果具有重要的作用。传统的抗肿瘤药物难以抑制肝癌干细胞,这是由于肝癌干细胞具有多药耐药的特点,其产生的主要原因是过表达ABC转蛋白,能够将进入细胞内的药物排出,降低药物作用。依克立达(Elacridar,ELC)是第三代P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)抑制剂,能够抑制ABC转运蛋白ABCB1和ABCG2。有研究表明,ELC与化疗药物联用能够提高肿瘤细胞对药物的敏感性,增强药物的抑制作用。本课题构建了一种共载递药系统,以PLGA为载体,包载抗肿瘤药物阿霉素(DOX)和ELC,以期共同杀伤肝癌细胞和肝癌干细胞。第一部分,培养肝癌HepG2细胞系,并通过无血清悬浮培养获得HepG2微球体(HepG2-TS)。细胞毒性实验结果显示,游离DOX对HepG2细胞系和HepG2-TS的IC50值分别为0.230±0.0221μM和0.477±0.0514μM;游离ELC对HepG2细胞系和HepG2-TS的IC50值分别为9.266±2.609μM和13.740±4.271μM,结果表明HepG2细胞系对DOX更敏感,ELC细胞毒性较低;通过考察DOX和ELC在不同比例下对HepG2细胞系和HepG2-TS的杀伤,确定DOX和ELC联用对HepG2细胞系和HepG2-TS最佳协同比例为1:1(mol/mol)。第二部分,分别建立了DOX和ELC的体外测定方法。实验结果显示:在1~40μg/mL浓度范围内,DOX的线性回归方程为A=0.021C+0.002,R2=0.999,线性良好,特异性高,日内日间精密度均小于2%,提取回收率均大于98%;在0.5~100μg/m L浓度范围内,ELC线性回归方程为A=120742.4626C+1974.5704,R2=1.0000,线性良好,特异性高,日内日间精密度均大于98%,提取回收率均小于2%,符合实验要求。第三部分,以PLGA为载体,TPGS为表面活性剂,按照纳米粒沉淀法分别制备了空白纳米粒(NB)、载DOX纳米粒(ND)、载ELC纳米粒(NE)和共载DOX和ELC纳米粒(NDE)。处方优化后,获得的共载纳米粒的粒径50nm左右,分布均匀,呈球形,Zeta电位在-15.6m V附进,两药的包封率和载药量较高且两药摩尔比约为1:1,达到协同比例;纳米粒在4℃条件下保存较为稳定;体外释放实验表明NDE具有较好的缓释效果,在pH5.5条件下,药物释放更快,累积释放率更高。第四部分,考察纳米粒体外抗HepG2细胞系和HepG2-TS的活性。以DOX为荧光探针,考察细胞对纳米粒的摄取情况,实验结果表明纳米粒能促进HepG2细胞和HepG2-TS对药物的摄取,提高药物的蓄积;分别利用细胞毒性实验、平板克隆实验以及微球体形成率实验考察纳米粒体外抗肿瘤活性,结果表明两药联用能提高药物对HepG2细胞和Hep G2-TS的细胞毒性,抑制细胞增殖和抑制微球体形成,纳米粒能够增强药物的抗肿瘤作用,其中ND和NE联用组与NDE组对HepG2细胞和HepG2-TS的抑制效果最强。第五部分,考察纳米粒体内抗肝癌活性作用。以DiR为荧光探针,考察纳米粒在荷瘤裸鼠的体内分布,实验结果表明,纳米粒组对肿瘤具有靶向性,能够较快的达到肿瘤部位,在肿瘤内蓄积较多;药代动力学实验结果表明纳米粒能够延长药物的半衰期,提高药物在体内的循环时间,显著提高药时曲线下面积;体内药效学实验结果表明空白纳米粒组系统毒性较小,游离DOX+ELC组虽然也具有较好的抗肝癌效果,但系统毒性较大,不利于联合给药,NDE组在体内的抗肝癌效果最强,肿瘤抑制率达到89.99±1.66%。综述所述,本课题构建的共载纳米递药系统-共载阿霉素和Elacridar的PLGA/TPGS纳米粒与游离DOX、游离ELC、两者联用以及单载二者的纳米粒相比具有较好的体内外抗肝癌作用,为肝癌治疗提供新策略。
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