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第一部分抗生素引起的菌群失调对急性铜绿假单胞菌肺炎的影响目的:抗生素是临床上治疗细菌感染的一线用药,然而临床研究发现它也是引起铜绿假单胞菌等多重耐药菌感染的独立危险因素之一,潜在机制有待验证。前述研究发现,菌群失调后,机体对感染性疾病的易感性增加。因此,我们猜想前期使用抗生素后造成机体的菌群结构破坏从而增加铜绿假单胞菌感染的易感性。方法:小鼠随机分组饲养于不同的笼位,以普通饮水(Water组)或含四联抗生素(Abt组)饲养3周,抗生素处理组在建立急性铜绿假单胞菌肺炎模型(经气管注入PAO1细菌悬液10~7 CFU/只)前3天停用抗生素改为普通水饲养;即一共分为4组:Water+PBS组、Abt+PBS组、Water+PAO1组和Abt+PAO1组。平板计数法检测小鼠肺组织和脾脏的细菌载量,观察各组小鼠的7天生存率,肺组织HE染色及炎症病理评分,ELISA和RT-PCR法检测小鼠肺组织炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10的表达情况,16S rRNA检测肺部和肠道菌群的改变。结果:生存率实验显示:Water+PBS组和Abt+PBS组小鼠全部存活,Water+PAO1组小鼠7天的生存率显著降低(约46%),而Abt+PAO1组小鼠在感染2天内全部死亡(p<0.05);细菌载量测定:Water+PAO1组中可见肺部有明显细菌存在(6.6±0.5 Log10CFU/g),而Abt+PAO1组肺部活菌数量更多(7.9±0.6Log10CFU/g)(p<0.01)。脾脏组织也检测到大量细菌存在,Water+PAO1组脾脏中活菌数约4.2±0.3 Log10CFU/g,Abt+PAO1组脾脏活菌数约4.8±0.5 Log10CFU/g(p<0.05)。HE染色及炎症病理评分:Water+PBS组及Abt+PBS组肺部未见明显炎性反应,Water+PAO1组小鼠肺组织结构破坏,可见大量中性粒细胞为主的炎性细胞浸润及多处脓肿灶。Abt+PAO1组小鼠肺部炎症及组织损伤较Water+PAO1组小鼠轻。肺组织炎症病理评分:Water+PAO1组19±0.8分,显著高于Abt+PAO1组15.7±0.9分(p<0.05)。细胞因子水平:炎症因子TNF-α、IL-6的mRNA和蛋白水平,Water+PAO1组较Abt+PAO1组明显升高,而Water+PAO1组的IL-10的mRNA和蛋白水平较Abt+PAO1组显著降低(所有p<0.01);肺部和小肠的菌群检测:抗生素处理组和对照组的肠道菌群结构有显著差异:在门水平上,Abt组的肠菌以变形菌门为主,其拟杆菌门、厚壁菌门和分支杆菌门较对照组显著减少;在属水平上,Abt组以克雷伯氏菌属、毛螺旋菌属为主,拟杆菌属较对照组显著减少。两组的肺部菌群结构组成(门水平和属水平)未检测到显著差异。另外,使用抗生素使肠道菌群的多样性显著降低,而肺部菌群的多样性未见明显差异。结论:与对照组Water+PAO1组比较,抗生素暴露组Abt+PAO1组死亡率更高,肺部和脾脏活菌数更多,肺部炎症因子TNF-α、IL-6和肺组织炎症细胞浸润较少,而抗生素暴露组的肠道菌群结构和多样性发生显著改变。提示抗生素暴露引起肠道菌群失调,肺部的炎症反应减弱以致机体不能有效清除铜绿假单胞菌,细菌易位,死亡率更高。第二部分菌群失调通过γδT-neutrophil轴加重急性铜绿假单胞菌肺炎目的:由第一部分结果可知,使用抗生素后肠道菌群失调,机体局部的抗菌反应减弱、铜绿假单胞菌肺炎严重。中性粒细胞在抗铜绿假单胞菌感染中是主要的固有免疫效应细胞之一,且最近的研究发现中性粒细胞受菌群调控,因此本部分研究拟从体液免疫和细胞免疫尤其是中性粒细胞入手探索机体的抗菌免疫在菌群失调后如何受损。方法:将实验分为4组,即Water+PBS组、Water+PAO1组、Abt+PBS组和Abt+PAO1组。ELISA法检测肺组织体液免疫反应的Ig A、Ig M、Ig G,测定肺部的髓过氧化物酶的表达情况,流式细胞术检测肺部的中性粒细胞和γδT17细胞,RT-PCR法检测肺部的中性粒细胞趋化因子Cxcl1、Cxcl2的表达。构建anti-TCRγδm Ab小鼠模型,在该模型上检测肺部和脾脏的细菌载量及生存率,以及中性粒细胞的比例,验证菌群对γδT细胞的作用。结果:Water+PAO1组和Abt+PAO1的肺组织在Ig A、Ig M、Ig G的表达无明显差异。与Water+PAO1组比较,Abt+PAO1组的髓过氧化物酶活性显著降低(Water+PAO1组1.796±0.112 U/克,Abt+PAO1组1.255±0.203 U/克)(p<0.001),肺部浸润的中性粒细胞比例较少(%:Water+PAO1组80.1±2.6,Abt+PAO1组66±7.3)(p<0.001),中性粒细胞趋化因子Cxcl1(mRNA:Water+PAO1组2.243±0.872,Abt+PAO1组1±0.198)、Cxcl2(m RNA:Water+PAO1组1.919±0.562,Abt+PAO1组1±0.168)及上游炎症因子IL-17A(Water+PAO1组536.908±71.609 pg/ml,Abt+PAO1组202.717±28.914 pg/ml)表达减少(p分别为p<0.01、p<0.01、p<0.001)。与Water+PAO1组比较,Abt+PAO1组的CD3+γδT细胞的比例和数量显著减少(p<0.05),CD3+γδT细胞分泌IL-17A的能力显著降低(p<0.05),CD3+γδT细胞的活化受抑制表现为CD44lo CD62Lhi(p<0.001)。构建anti-TCRγδm Ab小鼠模型后,与Water+Ig G control+PAO1组(%:84.7±3.371)相比,Water+anti-TCRγδ+PAO1组的中性粒细胞的比例(%:68.425±5.303)显著减少(p<0.01)。另外Water+anti-TCRγδ+PAO1组的肺部和脾脏的活菌数以及生存率与Abt+PAO1组类似。结论:菌群失调后,不影响肺部的免疫球蛋白Ig A、Ig M、Ig G的表达。菌群失调显著下调γδT17-neutrophil轴,导致抗生素暴露组对铜绿假单胞菌更易感。