出血性卒中(hemorrhagic stroke)是一种常见的脑血管疾病,发病率极高,颅内出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一种典型的卒中亚型,约占总卒中人数的15%,具有高死亡率和高发病率等特点。颅内出血患者即使原发性病灶清除后,仍然有40%患者存在进行性的神经功能损害,这就表明由凝血酶级联反应、血红蛋白降解物及炎症反应等介导的继发性损伤在颅脑损伤中占有重要作用。对于原发性损伤,目前尚无有效干预措施,只能通过早期预防,因此,明确颅内出血后继发性损伤的作用机制对于临床和科研具有重要的指导意义,且已成为脑卒中领域的重要研究方向。多项研究表明,在颅脑创伤和出血性卒中,炎症是颅内出血后引起神经元继发性损伤的主要因素。颅内出血后,外周中性粒细胞、单核巨噬细胞向血肿迁移,可诱导神经元炎症性损伤。颅内出血后,红细胞代谢产物,如血红蛋白和血红素(Hemin or Heme)也是诱导继发性神经元炎症性损伤的重要因素,已有相关文章报道,血红素可以引起小胶质细胞激活,释放炎症因子TNF-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、IL-6(interleukin-6,IL-6)和IL-1β(Interleukin-1β,IL-1β)等,进而诱导神经元炎症性损伤。血红素本身是一种脂溶性分子,一方面可以整合到细胞膜中,引起细胞膜氧化性损伤;另一方面,进入胞内的血红素可被血红素加氧酶(heme oxygenase,HO)分解,生成铁离子、CO和胆绿素,过量的铁离子和胆绿素可诱导神经死亡。目前研究多集中于血红素代谢产物的神经毒性和胶质细胞引起的神经元炎症性损伤,然而血红素直接诱导神经元死亡的机制尚不明确。通常认为神经元死亡的方式,可主要分为细胞坏死、细胞凋亡和程序性坏死三类;细胞坏死被认为是一种突发、被动、不可逆的细胞死亡方式,而细胞凋亡和程序性坏死都属于细胞程序性死亡,因此,通过调控细胞凋亡或程序性坏死,则是减缓颅内出血后继发脑损伤的重要途径。多项研究表明,程序性坏死在神经元继发性损伤中具有较之细胞凋亡更为重要的作用,当细胞发生程序性坏死时,RIP1和RIP3(Receptor interacting protein 1/3)形成复合物,并且进一步磷酸化mixed lineage kinase domain-like protein(MLKL),这种复合物称之为“坏死小体(necrosome)”。目前的研究多集中于血红素引起的神经胶质细胞凋亡和促炎机制,神经元对外界刺激的敏感性要远高于胶质细胞,由此我们推测:颅内出血后,血红素很可能直接诱导神经元死亡。近来研究发现,在缺血性脑损伤和兴奋性脑损伤的动物模型中,白介素1受体拮抗剂(IL-1 receptor antagonist,IL-1RA)或白介素1抗体可以减轻神经元死亡。但在ICH过程中,IL-1R(IL-1 receptor,IL-1R)是否参与神经元程序性坏死,进而影响神经元存活尚未见报道。为了进一步研究颅内出血后游离的血红素对神经元的影响,我们首先利用临床ICH标本,观察了血肿区necrosome的表达及细胞定位,以明确临床ICH患者神经元是否发生程序性坏死。然后,利用在体和离体颅内出血动物模型,对临床观察到的现象进一步验证,探讨了necrosome在动物ICH后表达变化规律及其在神经死亡中的作用;继而我们利用原代培养的神经元,对血红素诱导神经元发生程序性坏死的机制,以IL-1R1为突破口,从受体信号转导通路角度,深入研究神经元中necrosome的调控机制,最后再利用IL-1R1基因敲除小鼠对上述细胞学机制,实施进一步的活体验证。(1)ICH患者发生神经元程序性坏死通过收集28例颅内出血患者一般临床、头颅CT资料及相关临床标本,及IGCS(昏迷指数)评分的测定,结果表明颅内出血后,病人iGCS评分显著增高;MRI结合HE染色检测病理反应,结果表明,患者脑组织呈现血色素/铁色素沉着,液化性坏死及炎性细胞迁移;通过免疫染色检测HO-1和necrosome的表达,实验结果显示,HO-1(血红素的marker)仅在神经元表达,表明血红素可以特异靶向神经元,诱导神经元损伤并且发现颅内出血虽可诱导星形胶质细胞激活,但星形胶质细胞并不参与程序性坏死的激活,necrosome仅表达在神经元;进一步通过TUNEL染色和免疫染色检测caspase 3的表达,结果表明,caspase 3介导的细胞凋亡同样参与了颅内出血诱导的神经元死亡。上述结果表明,多种死亡方式都参与了颅内出血诱导的神经元死亡;颅内出血后血红素可直接靶向神经元并诱导其损伤。(2)血红素激活necrosome诱导神经元程序性坏死颅内注射血红素构建小鼠颅内出血模型,于术后取脑组织标本通过免疫组化和Western blot检测HO-1和necrosome的表达,结果表明,血红素处理后,HO-1主要在海马神经元表达,与临床标本结果相一致,且necrosome和HO-1的蛋白水平急剧上升;进一步通过ELISA(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测脑组织中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌,实验结果发现,血红素处理后,炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌量在第三天达到高峰,第五天逐渐下调。以上结果表明,血红素可以诱导神经细胞中HO-1表达,通过对HO-1定位可反映血红素作用的靶细胞;血红素通过两种方式导致神经细胞死亡:炎症性损伤和程序性坏死。(3)IL-1R1参与血红素激活necrosome诱导神经细胞程序性坏死分离小鼠海马神经元进行体外培养,血红素处理后,通过LDH检测血红素的神经毒性,实验结果表明,与对照组相比,血红素刺激后,细胞凋亡/坏死数量明显增加。具体表现为:LDH释放量上升,凋亡和坏死数量明显增加;通过Western blot检测necrosome和IL-1R1的蛋白表达水平,结果表明,血红素可诱导神经元中necrosome和IL-1R1表达上调;进一步通过ELISA检测患者脑脊液/细胞上清中炎症因子IL-1β的分泌,发现患者脑脊液中/细胞上清中IL-1β的分泌量上升;免疫染色确定临床脑组织IL-1R1的表达水平,并在动物模型中通过Western blot和免疫染色进一步验证IL-1R1的表达,实验结果表明患者脑组织/动物模型中IL-1R1的表达上调,且仅在神经元表达;最后,在原代海马神经元中采用免疫共沉淀检测IL-1R1和necrosome的关系,并在临床脑组织标本中通过荧光双标进一步验证IL-1R1和necrosome共定位,实验结果表明,血红素可诱导神经元IL-1R1和necrosome偶联,而IL-1RA可阻抑该偶联进而减轻血红素诱导的神经元死亡;荧光双标结果表明:颅内出血后IL-1R1和necrosome发生共定位。上述结果表明,颅内出血后,胶质细胞可分泌炎症介质诱导神经元的继发性损伤,本研究首次发现神经元同样可分泌炎症介质,并表达炎症受体,进而诱导神经元自身炎症性损伤;血红素通过两种方式促进神经元死亡:IL-1β介导炎症性损伤和necrosome依赖程序性坏死;血红素通过诱导IL-1R1与necrosome偶联启动神经元程序性坏死。(4)抑制IL-1R1活化可缓解血红素诱导的神经元程序性坏死分离小鼠海马神经元体外培养,IL-1RA预处理,检测LDH的释放,通过Western blot和免疫荧光检测necrosome的表达,并通过Annexin V-PI染色检测细胞膜完整性,结果表明,在预处理IL-1RA的体系中,细胞死亡数量明显减少,同时necrosome的表达和活化下调;IL-1RA可保护细胞膜完整性;IL-1RA和血红素共处理,IL-1RA仍可抑制necrosome的表达,减轻血红素诱导的神经元损伤;进一步通过免疫共沉淀检测是否IL-1RA可影响IL-1R1与necrosome的偶联,实验结果表明,IL-1RA可阻抑IL-1R1与necrosome偶联进而抑制necrosome的活化。以上结果表明,IL-1RA可抑制IL-1R1进而缓解血红素诱导的神经元程序性坏死(5)基因敲除IL-1R1减轻血红素诱导的神经细胞程序性坏死和炎症反应为了观察IL-1R1敲除小鼠对血红素诱导的神经损伤、脑积水和神经功能障碍的干预效应,将实验分为两部分,第一部分,构建颅内出血模型,血红素颅内注射6h后,分别给予IL-1RA(5μg)或vehicle(PBS)处理,术后通过Western blot和免疫荧光检测necrosome的表达,同时对小鼠神经功能障碍进行测定,结果表明,IL-1RA处理后,necrosome的表达在第一天明显降低,而在第三天略有上调,第五天逐渐降低,类似的,小鼠的神经功能评分在第三天略有上升,表明IL-1RA的治疗时间窗为24h。第二部分,假手术对照组,野生型小鼠和IL-1R1敲除小鼠分别注射血红素,于术后取脑组织通过Western blot和免疫荧光检测necrosome的表达,并对小鼠脑组织含水量、炎症因子分泌和神经功能障碍进行测定。结果表明,血红素脑室内注入引起急性脑室扩张、脑水肿和神经元变性损伤,基因敲除IL-1R1可降低颅内出血后necrosome的表达,改善小鼠后期脑积水和神经功能缺陷。综合上述结果,血红素可以直接导致神经元发生程序性坏死,血红素诱导神经元IL-1R1表达上调,并与细胞内necrosome的偶联,启动RIP1-RIP3-MLKL活化,是神经元发生程序性坏死的关键环节。通过抑制IL-1R1的表达可抑制血红素诱导的神经元程序性坏死,减轻颅内出血后,脑组织炎症反应和急性脑水肿,促进神经功能恢复。抑制IL-1R1和necrosome偶联是控制血红素诱导神经损伤的重要机制和治疗靶点之一。