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目的本文旨在将干细胞与抗菌肽优点相结合,采用抗菌、免疫调节和感染创面修复综合治疗,为创面金黄色葡萄球菌感染的治疗提供新方法。具体地说,本实验采用人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)作为种子细胞,将抗菌肽LL-37通过转基因技术转染到细胞内,检测抗菌肽LL-37在hUC-MSCs中的基因表达状况,并证实经转染抗菌肽LL-37后的干细胞释放出外分泌物质,其培养上清液对金黄色葡萄球菌具备较强的抑菌效应,目的是为临床上有效治疗、合理应用非抗生素类的抗感染药奠定理论基础。方法1.采取组织分离法提取细胞后,传代、冻存、复苏等常规方法培养h UC-MSCs,每次换液时应用倒置显微镜观察所培养的细胞形态变化特点。2.将提取完成的hUC-MSCs应用流式细胞仪进行鉴定,检验是否符合干细胞的细胞免疫表型。3.构建和包装慢病毒载体用于搭载抗菌肽LL-37基因,并且选用荧光法测定慢病毒的滴度值。4.选取处于对数生长期的hUC-MSCs进行细胞分组,标记为3组,进行转染携带抗菌肽LL-37慢病毒载体的hUC-MSCs标记为实验组;进行转染未携带抗菌肽LL-37空载慢病毒载体的hUC-MSCs标记为空载体组;未进行转染等特殊处置、常规换液培养的hUC-MSCs标记为对照组。操作时,对实验组及空载体组的细胞分别进行相应的转染,而对照组的细胞不做特殊处理、常规换培养液即可。观察时,每次使用倒置显微镜进行观察各组细胞的形态学特征;对于进行转染的两组:应用荧光显微镜观察细胞状态而且计算转染效率多少,指标是确保使转染效率大于80%,才能进行后续的抑菌实验。换液时,收集培养上清液,并按照体积比15:1的比例使用Ultra-15超滤管进行浓缩,浓缩完成后,应用过滤器进行过滤除菌并储存于-80℃冰箱,以备抑菌实验使用。5.应用Western blot方法检测各组LL-37表达状况。6.应用ELISA方法测定各组细胞的培养上清液中所含有LL-37蛋白的浓度。7.采用细胞划痕实验以检测各组别的细胞运动能力、生长能力状况。8.酶标比浊法检测携带LL-37基因的hUC-MSCs细胞培养上清液抗菌活性。9.对各实验环节所得到的实验数据进行归类整理,并采用统计学软件分析:SPSS 23.0和GraphPad Prism6软件。结果1.成功培养出提取所得细胞。2.流式细胞仪检测结果显示,细胞的表面CD90~+100%、CD105~+98.04%、CD73~+100%均>95%;CD34~+、CD45~+、CD11b~+、CD19~+、HLA-DR~+均<5%;符合hUC-MSCs的免疫表型鉴定标准。3.成功构建慢病毒载体,并包装了LL-37慢病毒载体,测定其滴度为1×10~122 TU/L。4.成功转染至hUC-MSCs,转染72 h后可观察到细胞呈现绿色荧光,转染效率为85.40%。5.运用Western blot方法结果,实验组抗菌肽LL-37转染后可增强h UC-MSCs,能够让抗菌肽LL-37蛋白表达量增加。6.ELISA方法结果表明抗菌肽LL-37转染能够增强hUC-MSCs,会让培养上清液LL-37蛋白增加。7.细胞划痕实验结果表明,各组细胞运动、生长能力均良好,LL-37转染或空载体转染均未对hUC-MSCs细胞生长形态造成明显影响。8.酶标比浊法结果表明,抗菌肽LL-37转染h UC-MSCs完成,所收集到的培养上清液对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌作用,抑菌率为98.74%(P<0.05)。结论1.在慢病毒介导下,抗菌肽LL-37可以成功转染至hUC-MSCs,并且慢病毒并未对抗菌肽LL-37和干细胞造成明显的影响作用。2.与抗生素相比,转染抗菌肽LL-37的hUC-MSCs培养上清液对金黄色葡萄球菌也具有显著抑制效果。