一、研究背景糖蛋白广泛存在于细胞膜和细胞间质中,由寡糖和蛋白质以共价方式连接而成。绝大多数寡糖是其相应的糖蛋白的功能中心,在细胞识别、信号传递中起关键作用。糖链的形式有多种,其中N-糖链的结构改变是细胞恶性转化的关键步骤。多数研究证明在肿瘤细胞中,常发现糖蛋白结构的异常增加,出现了肿瘤组织“异常糖基化”。发生这种变化的具体机制尚不清楚,但在大多数情况下,糖基转移酶的激活起着主要的作用。糖基转移酶在糖蛋白的合成中起关键作用。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶分布于高尔基体,其主要功能是在核心五糖基础上形成多分支结构,将供体底物UDP-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）中的GlcNAc （Gn）糖基转移至N-聚糖五糖核心的两个甘露糖。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶至少有6种,其中N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V（N-acetylglucosaminyltransferase V, GnT-V）是目前研究最多的。在正常体内,GnT-V是参与N-糖链生物合成的酶类,是糖蛋白N-糖链加工酶之一,具有决定N-糖链类型及复杂型糖链结构的重要作用。在高尔基体内催化形成N-糖链的β1,6分支,将核糖体合成的蛋白进行糖基化修饰。在多数肿瘤细胞中,细胞表面出现分子量更大的糖链,主要就是GnT-V高表达引起N-糖链β1,6分支增加,GlcNAcβ1,6 Man a 1,6结构有利于外链的延伸,可进一步合成N-乙酰氨基乳糖重复顺序。已发现该结构与细胞的恶性转化和肿瘤的转移有密切关系。采用L-PHA凝集素（可以特异识别β1,6分支糖链结构）分析了几种不同的肿瘤细胞,发现β1,6分支结构糖链的增加与GnT-V活性增高完全一致。Chakraborty等则证实肿瘤细胞表面β1,6分支天冬酰胺连接型糖链的存在促进其对基膜的入侵。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V （N-acetylglucosaminyltransferase V, GnT-V）除了具有糖基转移酶催化活性这一特征外,最近有研究表明N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V是一个高尔基体酶,在某些肿瘤细胞中,可被分泌到培养基中,其分泌机制还不能确定。但是被分泌出细胞的GnT-V在生理浓度范围内能引起肿瘤血管生成,而肿瘤血管生成是肿瘤转移的关键。RNAi技术是指在生物体细胞中,外源性或内源性的双链RNA （double2st randed RNA, dsRNA）引起与其同源mRNA的特异性降解,而抑制其相应基因表达的过程。RNA干扰具有高效性,稳定性,特异性等优点,它选择性地沉默肿瘤细胞内的癌基因和抑癌基因,抑制其功能表达,分析其表型的改变,有利于揭示肿瘤发生与病变的分子机制,从而为肿瘤的诊断和治疗提供治疗靶点。本课题旨在利用RNA干扰技术,将靶向针对GnT-V的shRNA质粒转染进肝癌细胞,用cck-8增殖实验,划痕实验,趋化运动试验以及体内皮下成瘤实验来观察肝癌细胞增殖和迁移能力的改变,为肝癌分子靶向治疗研究中新靶标的确定提供客观依据。二、研究目的将靶向针对高表达基因GnT-V的shRNA表达质粒转染进人肝癌HepG2细胞,观察GnT-V的表达变化对HepG2细胞体外及体内增殖和迁移能力的影响,为肝癌分子靶向治疗研究中新靶标的确定提供客观依据。三、实验方法1、pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA质粒的构建及鉴定已由本课题组成员贺富丽完成,方法如下：a. GnT-VsiRNA序列的设计：按照siRNA设计原则,利用Ambion公司提供的"siRNA Target Finder and Design Tools",根据NCBI数据库中GnT-V基因（NM₀02410.3） cDNA,设计针对GnT-V cDNA的RNA片段,序列分别如下：sense 5’GGAAGTGCATGCAACTGTTTA 3’, sense 5’CTCCTTTGA CCCTAAGAAT3’。分别命名为GnT-V/1564和GnT-V/2224。将其中一对的序列打乱排列,经Blast比对,无任何同源性超过70%的序列,作为阴性对照干扰序列,序列如下：sense 5’GTTCTCCGAACGTGTCACGT 3’,命名为GnT-V/NC。b. shRNA转录模板DNA的设计：根据前面设计的siRNA序列,设计模板DNA链,其顺序分别为BbsⅠ酶切位点、正义序列、9nt loop连接序列、反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子（6个T）、BamHⅠ酶切位点。c.质粒pGPU6/GFP/Neo GnT-V的构建及鉴定：先将各组2条模板单链退火处理,再与双酶切后的pGPU6/GFP/Neo质粒连接,构建成重组体质粒。将重组体转化大肠杆菌DH5α,筛选卡那霉素抗性克隆,利用限制性内切酶BbsⅠ和BamHI双酶切及测序鉴定重组质粒。大量扩增摇菌后,抽提质粒纯化。2、细胞培养人肝癌细胞株HepG2在37℃5%C02条件下,培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640中,每周传代2-3次。HepG2细胞培养至对数生长期,用脂质体Lipofectamine:2000TM将质粒导入HepG2细胞。用G418筛选阳性细胞克隆。3、细胞转染HepG2细胞培养至对数生长期,用脂质体Lipofectamine2000TM将质粒导入HepG2细胞。用G418筛选阳性细胞克隆。4、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰效果检测a.RT-PCR测定GnT-V mRNA用Trizol提取对数生长期的单层培养细胞总RNA,采用AMV逆转录合成cDNA. GnT-V上游引物为5’ AACTCTTGGACCATCCTGGGTTC 3’,下游引物为5’ TTGCTGCTTTTGGGTGGGTT 3’。β-actin作为内参,上游引物为5′GAAACTACCTTCAACTCCATC 3’下游引物为5′CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC 3’。反应条件为：94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共36个循环,最后72℃再延伸10min。GnT-V扩增产物长度为555bp,β-actin长度为219bp。电泳后UVI凝胶成像系统摄像,Image-Pro Plus 6.0软件分析条带灰度值,用GnT-V/β-actin代表GnT-V的相对表达量。b.Western blot检测GnT-V蛋白表达提取总蛋白,用测定蛋白浓度,吸取50μg总蛋白,去离子水补至20μL,加入等体积2×上样buffer煮沸7min,离心后吸取30μL上样,经不连续SDS-PAGE电泳分离后,用半干法电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉37℃封闭2h, TBST洗膜后用羊抗人GnT-V蛋白多克隆抗体（1：200）、鼠抗人GAPDH蛋白单克隆抗体（1：1000）4℃孵育过夜,洗膜后分别加入HRP标记的兔抗羊IgG（1：500）、HRP标记的羊抗鼠IgG（1：5000）,室温下摇动1h,洗膜后用ECL化学发光系统检测,暗室曝光X线片,冲洗胶片,UVI凝胶成像系统摄像,Image-Pro Plus 6.0软件分析条带灰度值,用GnT-V/GAPDH代表GnT-V的相对表达量。5、CCK-8检测pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰后对HepG2细胞增殖能力的影响取HepG2 GnT-V/1564和HepG2 GnT-V/NC对数生长期的待测细胞,CCK-8法分析不同时间点的细胞活力（0h、24h、48h、72h、96h）,每个时间点分别检测6个复孔。测量两组的OD450nm值,绘制生长曲线,并计算HepG2 GnT-V/1564的生长抑制率。细胞生长抑制率（IR）=（对照组OD450值—干扰组OD450值）/对照组OD450值×100%。6.pGPU6/GFP/Neo GnT_V shRNA干扰后对HepG2细胞迁移能力的影响a.趋化运动实验取HepG2 GnT-V／1564和HepG2 GnT-V／NC对数生长期的细胞,用无血清RPMl1640培养过夜。通过24孔趋化小室检测细胞迁移性,趋化因子为10%新生牛血清。计算穿过聚碳酸酯膜的细胞数,显微镜下每个复孔随机取5个高倍镜视野计数（400×）。b.划痕愈合实验取HepG2 GnT-V／1564和HepG2 GnT-V／NC对数生长期的待测细胞,细胞接种于包被CollagenⅣ的6孔板,培养至细胞呈单层贴壁生长状态。分别在各组单细胞层上划痕,用含10%FBS的培养基继续培养以使划痕愈合。分别于划痕后0h、12h、24h、36 h每个孔取4个视野拍照,观察划痕愈合能力,用愈合率代表愈合能力。愈合率=[（愈合前两侧细胞层距离-愈合后两侧细胞层距离）／愈合前两侧细胞层距离]×100%。7、裸鼠成瘤实验取HepG2 GnT-V／1564和HepG2 GnT-V／NC对数生长期的细胞,调整细胞浓度为2.5×107/mL,按100μL/只进行臀部皮下注射。左臀部：HepG2 GnT-V／NC组,右臀部：HepG2 GnT-V／1564组。8、统计学分析实验结果均经SPSS13.0软件统计。两组比较采用t检验,多组比较采用方差分析,以P<0.05表示有统计学意义。四、结果1、重组质粒的稳定转染质粒pGPU6/GFP/Neo中含有编码GFP的基因,稳定转染的细胞在荧光显微镜下可激发出绿色荧光。在荧光显微镜下观察,大部分细胞均发荧光,说明稳定转染成功。2、pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA干扰效果检测HepG2 GnT-V/1564, HepG2 GnT-V/2224和HepG2 GnT-V/NC组的细胞均能扩增出555bp的GnT-V基因片段,条带强弱不一致。HepG2 GnT-V/1564和HepG2 GnT-V/2224组细胞GnT-V基因的表达较HepG2 GnT-V/NC组明显降低,表明转染GnT-VshRNA载体可抑制目的基因mRNA表达,Western blot结果也显示转染GnT-VshRNA载体抑制GnT-V蛋白表达。Image-Pro Plus 6.0软件分析GnT-V基因mRNA及蛋白的表达水平,按照公式进行计算后显示HepG2 GnT-V /1564、HepG2 GnT-V/2224组mRNA水平的抑制率分别为83%和61%,蛋白水平的抑制率分别为71%和54%,与HepG2 GnT-V/NC组相比均有统计学意义（P<0.001）。选择干扰效率较高的HepG2 GnT-V/1564进行下一步实验。3、pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA对细胞增殖的影响以HepG2 GnT-V/1564和HepG2 GnT-V/NC细胞在不同时间点（Oh、24h、48h、72h、96h）的OD450nm值绘制细胞生长曲线,并计算出HepG2 GnT-V/1564的生长抑制率,可见GnT-VshRNA对HepG2细胞增殖呈明显的抑制作用,与对照组相比有统计学意义（P<0.001）。4. pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA对细胞迁移性的影响划痕实验显示抑制GnT-V表达量后,HepG2 GnT-V/1564组伤痕愈合时间长于HepG2 GnT-V/NC组,两组差异有统计学意义。Transwell趋化实验结果显示,HepG2 GnT-V/1564和HepG2 GnT-V/NC穿过聚碳酸酯膜的细胞数分别为（7.25±1.25）个和（25.65±1.39）个,两组差异有统计学意义（t=6.138,P=0.000）。5. pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA对裸鼠皮下成瘤实验的影响HepG2 GnT-V/NC组与HepG2GnT-V/1564组瘤体的平均重量分别为（1.72±0.36）g和（1.00±0.39）g。两组差异有统计学意义。（t=3.308,P=0.008）。五、结论1、pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA真核表达质粒可以显著下调GnT-V mRNA和蛋白表达量。2、下调GnT-V的表达后,HepG2细胞的体外增殖和迁移能力受到抑制。3、下调GnT-V的表达后,HepG2细胞的体内增殖能力受到抑制。4、该GnT-V的siRNA序列可能成为治疗肝癌的新的有效靶点。