在有花植物的生命周期中,孢子体世代占据主导地位,胚胎与胚乳作为孢子体发育的起点,对植物的生长和发育至关重要。线粒体作为真核生物中一个古老的细胞器,必然在早期孢子体发育过程中发挥重要作用。在人和酵母中,线粒体蛋白TIM9和TIM10(translocase of the inner membrane9and10)通常以复合体TIM9：10的形式存在,游离在线粒体内外膜间隙之间,并且是线粒体载体蛋白运输途径上的一个重要组成部分。到目前为止,研究人员对TIM9和TIM10蛋白在植物体中的生物学功能却知之甚少。本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)AtTIM9和AtTIM10基因的相关突变体为实验材料,利用杂交技术、胚胎透明、基因转化、原位杂交、实时定量PCR、酵母双杂交、CO-IP、BiFC、超薄切片、胚胎活体分离和免疫荧光等遗传学、细胞生物学和分子生物学技术,揭示了拟南芥TIM9和TIM10蛋白均能通过控制线粒体的活性和功能,从而非冗余性地调控早期胚胎细胞和胚乳游离核的分裂及发育。获得的主要结果如下：1.作者从拟南芥突变体库ABRC和NASC获得了AtTIM9和AtTIM10基因的3个T-DNA插入突变体,分别命名为tim9-1,tim9-2和timl0。鉴定后发现,3个突变体均为杂合体,角果中均出现胚珠白化和败育的表型,败育率均接近25%,且在后代中均未发现纯合体的种子。同时,对自交后代进行抗性筛选发现分离比为有抗：无抗=2：1,以上结果说明tim9-1/+,tim9-2/+和tim10/+均为胚胎纯合致死突变体；将这3个突变体分别与野生型互交,发现突变体的雌、雄配子育性正常,说明纯合的胚胎致死与配子体发育无关,主要由胚胎自身发育异常引起：分别对tim9.1/+,tim9-2/+和tim10/+进行转基因回复突变,结果显示转基因株系的表型得到回复而未出现胚珠败育,进一步确证AtTIM9和AtTIM10基因的缺失能够引起拟南芥胚胎致死。2.对各突变体角果中白化胚胎通过透明观察发现,tim9-1/+, tim9-2/+和tim10/+中致死胚胎均停滞在16/32-细胞时期；跟踪突变体中不同时期胚胎的发育情况发现,角果中大约四分之一的胚胎较野生型胚胎发育明显迟缓,并最终停滞在16/32-细胞时期；同时,统计白化胚珠中游离胚乳核的数目发现,胚乳游离核的分裂也相应停滞在早期胚胎的16/32-细胞时期。对tim9-1/+和tim10/+进行突变体双杂交,获得tim9-1/+tim10/+株系后,统计其角果的败育率为43.52%,符合孟德尔遗传定律,且其中异常胚胎的发育更加延迟,但最终仍停滞在16/32-细胞时期。结果表明,AtTIM9和AtTIM10基因的缺失将同时影响早期胚胎细胞及胚乳游离核的分裂。3.作者通过Genevestigator数据库预测到AtTIM9和AtTIM10基因在植物体中泛表达,且在种子中有相对较高的表达；对AtTIM9和AtTIM10基因自身启动子连接GUS报告基因的转基因植株染色发现,两个基因均在细胞分裂旺盛的组织和生殖器官中明显表达,且在胚胎与胚乳发育的各个时期都显示有GUS活性；qRT-PCR实验证实了AtTIM9和AtTIM10基因的转录本在上述各个组织中广泛表达；通过原位杂交技术,对AtTIM9和AtTIM10基因转录本在胚珠中的表达水平进行了检测,结果显示它们在胚胎与胚乳中均有表达信号。AtTIM9和AtTIM10基因表达的结果与它们参与早期孢子体发育的功能是一致的。4.对拟南芥AtTIM9和AtTIM10与其它4个真核物种间的TIM9和TIM10蛋白进行了同源性比对分析。多重序列比对发现它们的氨基酸序列高度同源,而且在TIM9和TIM10蛋白序列中都含有2个CH3C的保守结构域；对AtTIM9和AtTIM10进行蛋白3D结构同源模建并将其与酵母的结构重叠,结果显示它们在二级结构上也十分保守,表明AtTIM9和AtTIM10蛋白在真核物种间具有高度的同源性。5.对AtTIM9和AtTIM10蛋白进行亚细胞定位的研究,作者通过获得GFP融合蛋白的转基因株系,观察到两者都定位于拟南芥原生质体的线粒体上；通过酵母双杂交、CO-IP和BiFC等实验技术研究了这两个蛋白的相互作用,发现AtTIM9和AtTIM10蛋白在拟南芥植物体内能够相互结合,同时也定位于线粒体上,表明AtTIM9和AtTIM10蛋白与其他物种一样在拟南芥中也是以复合体的形式存在。6.通过早期胚胎分离技术,从tim9-1/+和tim10/+突变体白化胚珠中获得了纯合致死的胚胎,观察到该胚胎发育到16/32-细胞时期,胚体细胞内的线粒体活性丧失,但在胚柄细胞中表现正常；对其进行超薄切片发现胚体与胚乳细胞的线粒体结构异常,内含物减少且嵴的结构消失,而胚柄细胞的线粒体结构正常；进一步检测发现这些位于16/32-细胞时期的异常胚胎中,胚体细胞的线粒体膜通透性异常升高,且细胞色素c从线粒体释放至细胞质中；同时,胚体细胞和胚乳开始发生细胞程序性死亡,从而导致了纯合突变体早期胚胎与胚乳停止分裂并死亡。这些结果揭示了AtTIM9和AtTIM10蛋白对维持线粒体的正常生命活动十分必要,它们的缺失将导致早期胚体与胚乳中的线粒体功能障碍,从而影响拟南芥早期孢子体发育。7.作者还筛选了T-DNA随机插入突变体库中与胚胎发育相关的突变体株系。从T1代筛选的880个单株中,共发现66个株系具有胚珠败育的表型,继续种植并观察到其中29个株系的表型能够稳定遗传到T3代。详细分析这29个株系的胚珠与胚胎表型,结果显示其中5株具有胚珠空位的表型,13株具有胚胎发育异常的表型,11株具有胚胎发育异常的表型。将实验室得到的所有这些有表型突变体株系汇总后,作者就11株具有胚珠空位表型的株系通过Tail-PCR的方法对其侧翼序列进行基因鉴定,最后获得了其中2个株系的T-DNA插入位点,正在进一步研究和分析。