新药的研发与人类健康息息相关。当前,药物的研发模式已从盲目、随机和偶然性的开发转变为以药物靶点为导向的定向、针对性强的研究方式,体现出特异、快速、高效的特点。新药研发包括药物靶点的发现与确证、药物筛选模型的建立与先导化合物的获得、药物临床前研究与临床药效评价等多个环节,这中间均涉及到药理学不同方面的内容和技术,因而药理学的发展促进了药物的研发过程,药物发现与评价离不开药理学方法和技术的提升。　　 当人类进入新世纪后,心脑血管疾病己上升到全球疾病谱的第一位,每年因此而丧生的人数占到总死亡人数的三分之一以上。血管的病变,包括血管结构的异常和功能的障碍,是大多数心脑血管疾病的主要发病原因之一,这些疾病均归为血管性疾病。目前临床上用于防治血管性疾病的药物种类很多,且多数被证实具有良好的治疗作用。但这类药物往往治标不治本,需要患者终生用药；其中有些药物毒副作用较大,影响长期用药的依从性以及临床疗效。另外,一个非常值得重视的问题是,尽管现有的治疗手段较以往有了很大的改进和提高,但血管性疾病的发病率却仍呈逐年增加的趋势,同时控制率也未见提高。因而,新型血管性疾病防治药物的发现及其药效评价一直是药物研究的主要方向和目标之一。　　 本论文在前期研究的基础上,通过对防治血管性疾病药物的新靶点进行验证,并建立相应的药物筛选模型,以期发现新的先导化合物；同时对已发现具有活性的针对新靶点的候选化合物进行动物药效学评价,为其今后的临床试验研究及应用奠定基础。　　 一、尾加压素Ⅱ受体拮抗剂的筛选研究　　 尾加压素Ⅱ(UⅡ)具有广泛的生物学效应,是迄今发现收缩血管活性最强的物质。尾加压素Ⅱ受体(UTR)是上世纪末才发现的一种G蛋白偶联受体,广泛分布于人体各组织器官。研究发现,UⅡ在各种血管性疾病中扮演着极其重要的角色,己成为治疗高血压、动脉粥样硬化等血管性疾病的重要潜在靶点。本论文对这一新靶点的功能及其相关药物的发现做了初步的研究。　　 首先,本研究就UⅡ在血管性疾病中的作用及其机制进行了评价。我们发现UⅡ可增加血管平滑肌细胞骨架蛋白的表达和黏着斑的形成,表明UⅡ可通过促进平滑肌细胞骨架的重排来诱导其表型转化,从而增加其迁移能力,影响血管壁的结构和功能。进一步的研究表明,血管平滑肌细胞受到UⅡ刺激后,其分泌炎性介质ICAM-1和VCAM-1明显增加,iNOS和VEGF的mRNA表达水平也明显升高；而内皮细胞受到UⅡ刺激后,其合成与释放NO的能力则明显降低。由此可见,UⅡ促进血管平滑肌细胞增殖和迁移的机制可能与其增加血管的炎性反应有关。　　 其次,我们针对UTR这一新靶点建立了其拮抗剂的筛选模型。本研究采用计算机虚拟筛选技术,以GPCR的立体结构模板同源模建hUTR的三维结构；在此基础上采用基于受体的虚拟筛选方法将样品库中一万多个小分子化合物与模拟的hUTR进行高通量分子对接,筛选出与hUTR结合能力最高的前500个化合物,为后续实际药物筛选提供保证。与此同时,我们构建了高表达hUTR的HEK293稳定转染细胞株,利用时间分辨荧光能量共振转移技术在细胞水平将虚拟筛选出来的500个化合物进行了实际的受体-配体结合筛选实验,初筛发现了12个具有一定拮抗UTR活性的化合物,但在复筛中它们均未表现出受体拮抗活性。综上所述,我们建立起了一套完整的hUTR受体拮抗剂细胞高通量筛选模型,这类模型也能推广应用于其他GPCR受体结合实验及相关的药物研发,具有很好的研究和应用前景。　　 二、体内血管损伤性模型的建立及Rho激酶抑制剂作用的评价　　 在本部分中,我们考察了两种血管损伤模型中血压和血管功能的改变的情况,分别是L-NAME诱导的内皮功能损伤模型和维生素D3与尼古丁联合诱导血管钙化两种模型。结果表明,长期给予L—NAME可诱导大鼠形成持续、稳定的高血压状态,同时影响胸主动脉的舒缩功能；而血管钙化模型则对大鼠血压和血管功能的影响不大。因此,我们最终选用L-NAME诱导大鼠高血压模型来评价Rho激酶抑制剂的作用及其机制。　　 Rho激酶是Rho的小分子G蛋白的效应物,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性,在高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压、脑血管痉挛、心肌梗死以及心力衰竭等多种心脑血管性疾病的发生、发展中起关键作用。因而,Rho激酶已成为当前针对血管性疾病药物研发的一个重要靶点。本室前期利用Rho激酶抑制剂高通量筛选模型获得若干具有较好抑制活性的小分子化合物,本研究选择了其中的黄连碱和DL0805在L-NAME诱导大鼠高血压模型上进行了药效学评价,同时也研究了两者对血管结构和功能以及高血压受累器官心脏、肾脏的影响及其作用机制。　　 对血管的研究结果表明:1)黄连碱和DL0805对L-NAME诱导大鼠高血压模型没有降压作用,对心率的影响较小。2)黄连碱和DL0805能通过阻滞电压依赖型Ca2+通道和受体调控型Ca2+通道来降低血管对收缩因子NE、KCl、CaCl2以及PDBu等的反应性；但对血管舒张功能的改善无作用。3)病理学研究显示,黄连碱的高剂量组及DL0805可降低血管中膜层的厚度,提示Rho激酶抑制剂在一定程度上可抑制血管平滑肌细胞的增殖和肥厚。4)从血液生化指标检测结果看,黄连碱和DL0805可增加血浆中NO含量,同时降低ROS的水平,提高SOD活性与GSH水平、降低MDA含量,表明Rho激酶抑制剂可通过抗氧化应激而发挥保护靶器官的作用。5)Western blotting结果显示,黄连碱和DL0805能明显逆转RhoA/ROCK的过表达,并能在不同程度上降低p-eNOS、AMPK和Akt的表达水平。　　 对线粒体研究结果表明:黄连碱和DL0805均可提高肾脏和心脏线粒体呼吸链Ⅰ中的RCR和ADP/O,促进线粒体呼吸链Ⅰ的3态与4态呼吸速率,并可显著提高大鼠肾脏和心脏线粒体ATP含量以及线粒体中SOD和SDH的活性。　　 对肾脏的研究结果表明:1)病理学检查结果显示,黄连碱和DL0805可减小肾小球面积,改善肾脏病理状况。2)Western blotting结果显示,黄连碱和DL0805均能不同程度地下调:RhoA的表达；也能降低肾脏总ERK表达水平并显著增加p-ERK的表达,提示其通过激活ERK通路来发挥保护肾脏的作用。　　 综上,虽然Rho激酶抑制剂黄连碱和DL0805在L-NAME诱导大鼠高血压模型中未表现出降压效果,但它们可通过影响Ca2+通道调节血管收缩功能,减少氧化应激反应,下调RhoA/ROCK的表达水平,从而逆转血管壁的病理性增生,同时可改善L-NAME诱导高血压大鼠肾脏、心脏的线粒体功能,并通过影响RhoA/ROCK及ERK通路而减少肾脏的结构和功能性病变。由此可见,黄连碱和DL0805通过抑制Rho激酶活性发挥保护高血压受累器官如血管、肾脏、心脏的作用。　　 三、匹诺塞林对脑血管疾病的作用研究　　 缺血性中风(即脑缺血)是由于脑血管栓塞导致的大脑供血中断而引发一系列病理生理性损伤的疾病,为血管性病变的一种。当前的治疗药物除了溶栓药外,其余几乎均为神经保护类药物。本室经过十多年的研究,发现匹诺塞林具有较好神经保护以及舒张血管的作用。为进一步确证其在脑缺血中的疗效,我们研究了匹诺塞林在局部脑缺血再灌注大鼠中的治疗时间窗,并评价了其在全脑缺血再灌注大鼠模型中的治疗作用。　　 结果显示,在大鼠局灶性脑缺血再灌注1h、4 h、6 h后静脉注射给予匹诺塞林1mg/kg和5 mg/kg,均能改善大鼠神经行为学症状,减小脑梗塞体积,减轻脑水肿程度,其治疗时间窗为6 h。在大鼠全脑缺血再灌注模型中,匹诺塞林可减少脑水肿的发生,改善缺血后的神经行为学表现,而形态学检测结果也表明匹诺塞林可有效逆转缺血所导致的神经元死亡；同时,匹诺塞林还能剂量依赖性地降低大脑MDA水平,下调因过度氧化而激活的SOD活性,使其恢复到正常水平,减少MPO激活引起的炎症反应,综合调控中枢神经系统兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸递质的代谢平衡,从而发挥有效的神经保护作用。　　 以上结果表明匹诺塞林是一个具有抗脑缺血损伤并积极发挥神经保护作用的化合物,可能成为防治脑卒中类血管性疾病的新药物。　　 本论文对三个不同方面的血管性疾病药物靶点进行了研究,并对该类药物发现中靶点确证、模型建立与药物筛选、活性化合物的药效评价等重要环节进行了探讨,为新型血管性疾病防治药物的发现提供了实验基础。