论文部分内容阅读
目前,卵巢癌仍是女性致死率最高的恶性肿瘤,多数患者在确诊时已经处于晚期（Ⅲ-Ⅳ期）。目前,卵巢癌的主要的治疗手段依然是手术与以铂类为基础的化疗相结合等方式,但大多数患者在初次治疗后出现复发或转移,并出现对再次放化疗治疗的耐药,预后较差。因此,寻找新的化疗手段是卵巢癌治疗的研究方向之一。肿瘤微环境（tumor micro-environment,TME）与肿瘤的发生、发展密切相关。肿瘤相关的血管生成是组成肿瘤微环境的重要成分之一。在过去数十年中,包括大分子抗体和小分子靶向药在内的抗血管生成药物在实体瘤治疗中显露头角。阿帕替尼是一种高度特异性靶向血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2,VEGFR2）的新型酪氨酸激酶抑制剂,在临床上已经开始用于肿瘤抗血管生成的治疗。一些临床试验显示了阿帕替尼在复发性卵巢癌中的作用,但缺乏阿帕替尼在新诊断的卵巢癌中的应用证据。因此,寻找新型或联合的抗血管生成方法有助于改善卵巢癌患者的预后。外泌体是大小在30-150 nm的富含miRNA,蛋白质,脂质等物质的胞外囊泡,并可以作为细胞间通讯的交流媒介。MicroRNA（miRNA）是一类非编码RNA分子,由大约20个核苷酸组成,并在外泌体的复杂成分中占据很大比例。过去的研究表明,外泌体miRNA在肿瘤血管生成中具有一定的作用,但迄今为止,外泌体miRNA作为抗血管生成剂在肿瘤治疗中的潜力仍然有待研究。在本研究中,通过体外细胞实验与斑马鱼模型,我们对永生化卵巢上皮细胞来源的外泌体和卵巢癌细胞来源的外泌体对血管生成的作用进行了研究。并通过对SKOV3、A2780两株卵巢癌细胞株来源的外泌体与永生化卵巢上皮细胞来源的外泌体进行miRNA高通量测序以筛选差异表达的miRNA,结果显示,miR-92b-3p在卵巢癌细胞外泌体中的表达中稳定低于永生化卵巢上皮细胞外泌体。在此研究基础上,我们通过qRT-PCR、Western Blotting、双荧光素酶报告实验与与拯救实验等进一步验证了 miR-92b-3p靶向SOX4基因mRNA。此外,我们进一步构建了被DSPE-PEG2K-RGD 修饰的过表达 miR-92b-3p 外泌体（RGD-SKOV3-92b/exo）。裸鼠模型发现,RGD-SKOV3-92b/exo外泌体与阿帕替尼协同可以明显抑制体内肿瘤的生长和血管生成。我们的发现阐述了卵巢癌细胞外泌体miR-92b-3p对肿瘤相关血管生成的抑制作用和机制,并进一步探究了多肽修饰的装载miR-92b-3p的外泌体作为抗血管生成药物的潜在可能,为卵巢癌抗血管生成治疗提供了新的思路与方法。目的:明确永生化卵巢上皮细胞来源外泌体与卵巢癌细胞来源外泌体对体外和体内血管生成影响的差异。方法:首先,使用超速离心法提取永生化卵巢上皮细胞（immortalized ovarian epithelial cell line,IOSE-80）与卵巢癌细胞SKOV3、A2780来源的外泌体,并通过透射电镜、Western Blotting对外泌体进行鉴定。其次,使用共聚焦显微镜观察PKH-67绿色荧光标记的外泌体被人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）摄取的过程。再次,将不同来源的外泌体与HUVEC细胞共培养48h后,通过小管形成实验和Transwell实验检测外泌体对HUVEC细胞成管和迁移能力的影响。最后,通过显微注射,观察经外泌体处理的Tg（fli-1:EGFP）斑马鱼体内血管生成改变。结果:1.超速离心法可以有效提取永生化卵巢上皮细胞IOSE-80与卵巢癌细胞SKOV3、A2780细胞分泌的外泌体。2.外泌体可以被血管内皮细胞HUVEC摄取。3.与来源于永生化卵巢上皮细胞IOSE-80的外泌体（IOSE-80/exo）相比,卵巢癌细胞来源的外泌体（SKOV3/exo、A2780/exo）在体外可以明显促进血管内皮细胞HUVEC的成管和迁移能力。4.与来源于永生化卵巢上皮细胞IOSE-80的外泌体（IOSE-80/exo）相比,卵巢癌细胞来源的外泌体（SKOV3/exo、A2780/exo）在体内可以明显促进Tg（fli-1:EGFP）斑马鱼体内血管生成。结论:与永生化卵巢上皮细胞来源的外泌体相比,卵巢癌细胞来源的外泌体具有更强的促血管生成能力。第二部分 外泌体miR-92b-3p通过靶向SOX4调控血管生成目的:分析永生化卵巢上皮细胞来源的外泌体与卵巢癌细胞来源的外泌体中差异表达miRNA,确定目标miRNA及其下游靶基因,证明过表达该miRNA的外泌体对血管生成的影响。方法:首先,应用miRNA高通量测序技术对永生化卵巢上皮细胞来源的外泌体IOSE-80/exo与卵巢癌细胞来源的外泌体SKOV3/exo、A2780/exo进行测序,筛选出并通过qRT-PCR验证测序中表达差异显著（|Log2（Fold Change）|＞1.5）且表达量较大（表达量＞100）的miRNA,从中挑选与血管生成相关的miRNA分子,即miR-92b-3p。通过慢病毒稳定转染构建可以稳定过表达miR-92b-3p的SKOV3细胞系。通过小管形成、Transwell实验与斑马鱼模型分别研究miR-92b-3p及过表达miR-92b-3p的外泌体在体内外对血管形成的影响。其次,通过Targetscan、miRTarbase、miRDB及miRWalk等生物信息学预测软件对miR-92b-3p的靶基因进行预测后选择 SRY-B ox 转录因子 4（SRY-Box Transcription Factor4,SOX4）作为miR-92b-3p的可能靶基因,并通过qRT-PCR、Westernblotting、双荧光素酶报告基因实验与拯救实验等验证miR-92b-3p与SOX4的调控关系。最后,通过小RNA干扰与质粒过表达技术分别下调或上调血管内皮细胞中SOX4的表达,并通过小管形成和Transwell实验研究SOX4在体外对血管生成的影响。结果:1.与永生化上皮细胞来源的外泌体相比,miR-92b-3p在卵巢癌细胞来源的外泌体中的表达明显降低。2.MiR-92b-3p过表达的HUVECs显着减弱了小管形成和迁移的能力,而miR-92b-3p抑制的HUVECs显着增强了管形成和迁移的能力。荧光显微镜显示,与NC模拟物相比,miR-92b-3p模拟物注射的48 hpf斑马鱼的发芽和血管内皮细胞迁移明显减少。3.与SKOV3/exo相比,过表达miR-92b-3p的外泌体SKOV3-92b/exo在体外与HUVEC细胞共培养后,HUVEC的小管形成能力与迁移能力明显下降;在斑马鱼模型中,肠下静脉血管的分支明显减少。4.生物信息学软件预测和双荧光素酶报告实验结果均证明miR-92b-3p可以通过靶向结合SOX4基因mRNA中3’-UTR区域对其进行调控。qRT-PCR和Western blotting实验发现,上调miR-92b-3p后,SOX4表达下降;下调miR-92b-3p后,SOX4表达上升。5.过表达miR-92b-3p后出现血管内皮细胞HUVEC小管形成和迁移能力被抑制,这种抑制现象可以被共转染SOX4过表达质粒所拯救。6.过表达SOX4可以促进体外血管内皮细胞HUVEC的小管形成和迁移能力,并进一步促进Endothelin-1的表达和p-Akt/Akt通路激活;下调SOX4后上述能力及表达被抑制。结论:1.卵巢癌细胞来源的外泌体中miR-92b-3p低表达与卵巢癌血管生成密切相关。2.过表达miR-92b-3p的外泌体抑制卵巢癌血管形成。3.SOX4作为miR-92b-3p的直接靶基因,参与miR-92b-3p调控卵巢癌血管生成。第三部分 荷载miR-92b-3p修饰工程外泌体的抗血管生成作用目的:探究荷载miR-92b-3p的外泌体与抗肿瘤血管生成药物阿帕替尼联合的可能,并构建通过DSPE-PEG2K-RGD修饰的荷载miR-92b-3p的外泌体,加强其靶向血管内皮细胞的能力以进一步提高抗肿瘤作用。方法:首先通过CalcuSyn 2.0软件,计算miR-92b-3p与阿帕替尼对体外血管内皮细胞HUVEC小管形成和迁移能力协同抑制的药物联合指数（combination index,CI）,并在体内进一步验证。其次,通过小管形成实验和Transwell实验在体外验证荷载miR-92b-3p的外泌体与阿帕替尼的联合抗血管生成的作用。接着,我们选择通过将 DSPE-PEG2K-RGD 与稳定过表达 miR-92b-3p 的 SKOV3 细胞（SKOV3-92b 细胞系）共培养的方式,从而获得了外泌体膜上有DSPE-PEG2K-RGD修饰的装载miR-92b-3p外泌体（RGD-SKOV3-92b/exo）。通过共聚焦显微镜观察PKH-67标记的SKOV3-92b/exo与RGD-SKOV3-92b/exo被摄取速度的差异。使用稳定转染荧光素酶的SKOV3细胞（SKOV3-Luc细胞）构建裸鼠腹腔瘤模型,并分别将IOSE-80/exo、SKOV3/exo、SKOV3-92b/exo、RGD-SKOV3-92b/exo、SKOV3-92b/exo+miR-92b-3p Inhibitor通过尾静脉注射的方式和阿帕替尼口服给药的方式对裸鼠进行不同处理,通过活体显像评估不同处理对肿瘤生长的作用。最后,通过免疫组化染色CD31对裸鼠腹腔瘤的微血管密度进行计算。结果:1.在体外实验中,当miR-92b-3p浓度为5 nM且阿帕替尼为50 nM时,对血管内皮细胞HUVEC的成管和迁移能力的协同抑制作用最强。在体内实验中,较miR-92b-3p或阿帕替尼单独处理斑马鱼时,miR-92b-3p与阿帕替尼共同处理时对血管生成的抑制作用更加明显。2.与单独使用SKOV3-92b/exo或阿帕替尼的斑马鱼相比,用SKOV3-92b/exo和阿帕替尼（50 nM）联合治疗的HUVEC的管形成能力和迁移能力受到明显抑制。3.荧光共聚焦显微镜显示,在相同时间内,HUVECs摄取RGD-SKOV3-92b/exo的能力较摄取未修饰的SKOV3-92b/exo明显增加。4.在裸鼠模型中,在RGD-SKOV3-92b/exo和阿帕替尼同时处理的组别中,裸鼠腹腔肿瘤生长受限最明显。结论:1.miR-92b-3p和荷载miR-92b-3p外泌体与阿帕替尼均具有抗血管生成协同作用2.DSPE-PEG2K-RGD修饰外泌体可显著提高对血管内皮细胞的靶向性。3.荷载miR-92b-3p的DSPE-PEG2K-RGD修饰工程外泌体和阿帕替尼在裸鼠卵巢癌腹腔瘤模型中有联合抗肿瘤作用。