第一部分，目的:　　 胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,虽然近年发病率有所下降,但仍然严重威胁人类健康。虽然化疗、放疗、生物治疗和基因治疗在胃癌治疗中广泛应用,但胃癌侵袭和转移仍然是生存率无法大幅提升的主要原因。近年来分子遗传学研究证明,胃癌是异型性极强的恶性肿瘤,胃癌发生和发展是多阶段、多基因和多因素参与的复杂过程,这些基因主要包括癌基因、抑癌基因及DNA错配修复基因等。其中基因突变、杂合性丢失和启动子甲基化修饰等导致抑癌基因功能降低或缺失在肿瘤发生和演进中发挥重要作用,成为肿瘤学研究的一个热点,其中之一就是生长抑制基因(Inhibitorofgrowth,ING)家族。　　 生长抑制基因(ING)包括5个家族成员。其中,ING5定位于人染色体2q37.3,含有8个外显子和7个内含子,编码长为5233bp的cDNA中1068个核苷酸翻译成由240个氨基酸组成的28kDa蛋白质。从氨基到羧基末端ING5蛋白含有亮氨酸拉链样(LZL)、新保守区(NCR)、核定位序列(NLS)和植物同源结构域(PHD)。LZL结构域在DNA修复、凋亡诱导和染色质重建中发挥重要作用,NCR结构域在基因表达和染色质重建过程中参与组蛋白乙酰转移酶(HAT)复合体形成,NLS结构域决定了ING5蛋白核定位。因其具有抑制细胞生长并以p53蛋白依赖方式诱导细胞凋亡的生物学作用,ING5被认为是一种抑癌基因。ING5可诱导p53蛋白乙酰化,在乙酰化p53蛋白协同作用下形成HAT复合体或激活微染色体维持蛋白(MCM),分别在调节细胞S期DNA复制或组蛋白乙酰化中发挥作用。有研究显示,ING5可以通过调节p53蛋白激活周期素依赖激酶抑制剂p21/waf1启动子活性促进p21其表达,进而导致细胞G1期阻滞。　　 很多研究发现,恶性肿瘤发生过程中存在ING蛋白下调或者缺失,癌细胞中ING表达参与凋亡调节。许多体内外实验也发现ING蛋白调节细胞凋亡的作用。ING5的过表达可以导致集落形成效能的降低和S期细胞的减少,并且以P53依赖的方式诱导细胞凋亡。我们之前的研究显示结肠癌中ING5蛋白或mRNA组织含量升高,两者癌变过程中核ING5蛋白发生了浆移动和表达下调,核ING5表达与肿块大小、侵袭深度、去分化、临床病理分期或不良预后呈负相关,而浆ING5表达与肿瘤侵袭深度、淋巴管侵袭、淋巴结转移或临床病理分期呈正相关。　　 随着诊断和治疗技术的不断提高和广泛开展,胃癌的发病率和病死率在全世界范围均有所下降,但是胃癌仍是威胁人类的高发恶性肿瘤之一,而且病死率仍排在第二位。病理和遗传学研究提示胃黏膜上皮不典型增生大部分最终要恶变,然而,其分子机制尚未阐明。因此,我们推测ING5表达异常在胃癌发生和演进中发挥重要作用。本文研究了ING5在胃正常粘膜、不典型增生、癌组织和胃癌细胞系中的表达,并进行临床病理学资料分析和预后分析,以期发现ING5在胃癌进展过程中作用。　　 方法：　　 一、细胞培养:　　 五种胃癌细胞系,MKN28(高分化腺癌)、MKN45(低分化腺癌)、AGS(中分化腺癌)、KATO-Ⅲ(低分化腺癌)和GT-3(未分化腺癌)受赠于日本理化研究所。其中,MKN28、MKN45和KATO-Ⅲ在ERPMI1640培养液中培养,GT-3在DMEM@培养,AGS在Hams/F-12中培养,每种培养液中均加10%FBS,浓度为100units/ml。所有细胞经过收集、离心、PBS洗涤,然后提取总蛋白。细胞蛋白在应用核浆蛋白分离试剂盒分离(78833;PierceBiotechnology,Rockford,IL)。再次收集细胞,经过离心、PBS洗涤后,置入10%甲醛中固定,然后进行石蜡包埋,用于进一步实验。　　 二、胃癌标本的收集　　 胃癌石蜡标本来自于中国医科大学附属第一医院肿瘤外科1985年至2003年手术切除病例和KousereinTakaokaHospital1993年至2002年的手术切除病例,其中胃癌组织(GC)429例,癌旁非癌组织(NNM)119例。另外还有50例不典型增生来自中国医科大学附属第一医院内窥镜中心1990年至2009年的活检标本。另外还收集临床手术新鲜标本21例,包括癌组织和相对应的癌旁非癌组织,标本置于-80℃深低温冰箱保存直至实验所用。所有病例术前均未经过放化疗和其他辅助治疗。我们对每例患者进行电话随访。　　 三、病理学检查及组织芯片(tissuemicroarray,TMA)的制备　　 所有蜡块均切成4-μm厚的切片,然后进行HE染色,镜下确定组织学诊断和其他镜下特点。镜下确定每例切片的目的区域,然后再组织芯片机上制成2mm直径组织,放于组织芯片盒内(TMA;AZUMAYAKIN-1,Tokyo,Japan),之后对芯片盒内的组织在进行石蜡包埋,最后切成4-μm的切片进行免疫组化实验。　　 四、蛋白印记(Westernblot)检测ING5的蛋白水平　　 (1)将收集的病理标本,加裂解液(20mmol/LTris/HclPH:7.5,50mmol/LNacl,0.1mmol/LNa3Vo4,25mmol/LNaF,2mmol/LEDTA/EGTA,1mmol/LDTT,1mgl/L亮肽酶/抑肽酶)200μL,冰上放置30min,超声破碎20sec/次,3-4次。12000rpm离心20min取上清,即为总蛋白。　　 (2)收集细胞,用预冷的PBS洗涤2次,1000rpm/min离心5min弃上清。同上方法提取总蛋白。　　 (3)考马斯亮蓝法测定蛋白含量,取90μg总蛋白上样,经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后将蛋白电转移到NC膜上。根据分子量裁膜。5%脱脂奶粉室温封闭1h,加入ING5一抗(1:1000)4℃过夜,辣根过氧化酶标记的二抗室温作用1h。每次孵育后均用含5%的Tween-20的TBS洗脱3次,每次5min。待NC膜稍干后,在膜上滴加适量的ECL显影并上机扫描测灰度值。每组实验至少重复3次。(4)最后,StrongBuffer液洗膜,在加入内参β-actin单克隆抗体(1:1000)孵育,按上述步骤显影并测灰度值,进行统计学分析。　　 五、RT-PCR、电泳&测序　　 以提取并反转录的cDNA#3模板扩增目的基因:25μL反应体系含有Taq酶0.125μL和100ng模板cDNA。反应条件:95℃变性10分钟在经过32个周期95℃变性30秒,60℃(ING5)/55℃(β-actin)退火45秒,72℃延伸1分钟,最后一次延伸7分钟。扩增的产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,UVP凝胶成像检测,检测灰度值进行统计学分析。最后,将PCR产物进行胶回收(QIAGEN试剂盒),然后进行测序。　　 六、实时RT-POR　　 为了进一步确定RT-PCR的结果,我们又进行了实时RT-PCR检测。两步法扩增目的基因,95℃30s进行预变性;95℃5s,60℃34s40个循环进行PCR反应。20μL反应体系含有10μLSYBRPremixExTaq酶,0.08μL引物和0.4μLofROXReferenceDye和1μL模板cDNA。反应结束后获取Ct值,并根据2-△△Ct进行计算得出比例。　　 七、免疫组化　　 将切片先用2甲苯脱蜡,用酒精脱水,在进行抗原修复(微波炉高温高压法,抗原修复液选用pH值6.0的柠檬酸钠缓冲液)。然后用3%H2O2阻断内源性过氧化物酶,再用5%BSA阻断非特异性结合。之后用ING5抗体孵育4℃过夜(1:100),第二天用二抗孵育1小时,最后用DAB显色,苏木精复染,然后常规进行脱水、透明、封片。每次孵育前均在微波炉中杂交30分钟,每次处置前均用TBST洗三次。不加一抗做为阴性对照。　　 结果：　　 一、ING5在五种胃癌细胞系中的表达　　 通过蛋白印记和免疫组化,我们发现ING5在胃癌五种细胞系的细胞核中均有表达。为了从mRNA水平进一步验证,我们对五种胃癌细胞的RNA进行RT-PCR实验,结果发现ING5mRNA在五种胃癌细胞系中均有表达,且表达水平相似。进一步,我们将PCR产物进行测序检测1NG5是否存在突变。　　 二、INGS5在胃癌组织中的表达　　 在18例胃癌新鲜组织及对应正常粘膜中检测蛋白水平,发现6例(33.3%)癌组织高于正常,8例(44.4%)低于正常,4例(22.2%)无差别。经过统计学分析显示,在蛋白水平癌组织和正常粘膜的ING5表达无差别。进一步,我们又对15例标本进行了mRNA水平的检测,结果显示,12例(80%)癌组织高于正常,1例低于正常,2例无差别。经过统计学分析显示,在mRNA水平癌组织和正常粘膜的ING5表达有显著差别。我们又进行了实时RT-PCR,证实了我们的结果。　　 三、ING5的表达与胃癌患者临床病理学因素的关系以及生存分析　　 核ING5的表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移和UICC分期呈负相关(P＜0.05),与性别、淋巴管浸润和静脉浸润无关(P＞0.05)。核ING5在老年患者中的表达要高于年轻患者(P＜0.05)。相对应,浆ING5的表达与浸润深度、静脉浸润、淋巴结转移和UICC分期呈正相关(P＜0.05),而与肿瘤大小、性别、年龄、淋巴管浸润和核ING5表达无关(P＞0.05)。与弥漫性胃癌相比,肠型胃癌中的核ING5高表达,而浆ING5正相反。　　 我们对343例胃癌患者进行了随访(0.4个月-9.3年,平均78.0个月)。生存分析应用K-M法,单因素分析结果显示核ING5的表达与患者的累计生存期呈负相关(P＜0.05),而浆ING5无关(P＞0.05)。进一步经过Cox回归分析,结果提示核ING5的表达并不是影响胃癌患者预后的独立危险因素(P＞0.05)。浸润深度、UICC分期和Lauren分型是影响核ING5和胃癌患者预后关系的因素。　　 结论：　　 1.ING5蛋白表达参与胃癌发生的早期阶段,并且影响胃癌的生物学行为;　　 2.ING5的核浆移动对胃癌的生物学行为起到重要作用;　　 3.但是,胃癌中核ING5蛋白浆移动的分子机制还不清楚,有待进一步研究。　　 第二部分， 目的：　　 胃癌是我国发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一,各种化疗和基因生物治疗也效果不佳,胃癌的侵袭和转移是生存率明显降低的主要原因。近年来分子遗传学研究证明胃癌是异型性极强的恶性肿瘤,其侵袭和转移是多阶段多基因参与的结果,已经阐明的分子机制仍然无法解释所有的发生事件。因此深入研究胃癌侵袭和转移的分子机制,寻找新的分子治疗靶点,将有助于提高疗效,并为分子分型和分子分期提供线索。　　 化学趋化因子属于小分子分泌细胞因子,其主要的作用是可以促进各种白细胞的运动。由于白细胞的定向运动与肿瘤细胞的侵袭、转移十分相似,人们更加关注其在肿瘤侵润、转移中的作用。目前,已有大量研究证实化学趋化因子在各种肿瘤细胞中的表达,并进一步显示其在肿瘤进展和器官选择性转移中的作用。　　 CXCL16是新近发现的一种趋化因子,人类CXCL16基因定位于染色体17p13上,与已知的其它趋化因子相隔。CXCL16是唯一一个以两种存在形式的趋化因子:膜结合型和分泌型。CXCL16是继Fractalkine之后第二个以膜结合的方式存在的趋化因子,它在以跨膜结合的形式表达于树突状细胞表面时,可起到细胞表面的粘附分子的作用,与其它粘附分子协作介导与表达CXCR6的T细胞和NKT细胞结合。在ADAM10的分裂剪切作用下,膜结合型的CXCL16可脱落形成具有趋化活性的可溶性形式,招募表达CXCR6的活化的T细胞和NKT细胞。在目前已知的所有的趋化因子受体中,只有CXCR6是CXCL16的唯一受体。CXCR6是一个7次跨膜G蛋白偶联受体,含有7段跨膜区,基因位于第3号染色体上。　　 化学趋化因子及其受体在肿瘤的生长、侵润、血管形成和转移中起到了重要的作用,这一点已经得到众多学术团体的认可,因此,探讨CXCL16、CXCR6与恶性肿瘤发生、发展的关系及相关分子生物学机理不但可以推动恶性肿瘤病因学和治疗学的发展,而且可为恶性肿瘤靶向化疗药物研发和基因治疗提供科学的实验依据。　　 方法：　　 一、细胞培养:　　 九种胃癌细胞系,MGC-803、BGC-823、MKN28、MKN45、AGS、KATO-Ⅲ、SGC-7901、HGC-27和GES-1。其中,MGC-803、BGC-823、MKN28、MKN45和KATO-Ⅲ在RFMI1640培养液中培养,GES-1和SGC-7901在DMEM中培养,AGS在Hams/F-12中培养,HGC-27在MEM中培养,每种培养液中钧加10%FBS,浓度为100units/ml。所有细胞经过收集、离心、PBS洗涤,然后提取总蛋白。再次收集细胞,经过离心、PBS洗涤后,置入10%甲醛中固定,然后进行石蜡包埋,用于进一步实验。　　 二、胃癌标本的收集　　 胃癌石蜡标本来自于中国医科大学附属第一医院肿瘤外科1985年至2003年手术切除病例和KousereinTakaokaHospital1993年至2002年的手术切除病例,其中胃癌组织(GC)429例,癌旁非癌组织(NNM)119例。50例不典型增生来自中国医科大学附属第一医院内窥镜中心1990年至2009年的活检标本。另外还收集临床手术新鲜标本28例,包括癌组织和相对应的癌旁非癌组织,标本置于-80℃深低温冰箱保存。所有病例术前均未经过放化疗和其他辅助治疗。我们对每例患者进行电话随访。　　 三、病理学检查及组织芯片(tissuemicroarray,TMA)的制备　　 所有蜡块均切成4-μm厚的切片,然后进行HE染色,镜下确定组织学诊断和其他镜下特点。胃癌分期按照UICC标准。组织学类型按照Lauren分型标准。另外,同时观察肿瘤的浸润深度、淋巴管及静脉浸润。　　 镜下确定每例切片的目的区域,然后再组织芯片机上制成2mm直径组织,放于组织芯片盒内,之后对芯片盒内的组织在进行石蜡包埋,最后切成4-μm的切片进行免疫组化实验。　　 四、蛋白印记(Westernblot)检测CXCR6的蛋白水平　　 (1)将收集的病理标本,加裂解液(20mmol/LTris/HclPH:7.5,50mmol/Lnacl,0.1mmol/LNa3Vo4,25mmol/LNaF,2mmol/LEDTA/EGTA,1mmol/LDTT,1mgl/L亮肽酶/抑肽酶)200μL,冰上放置30min,超声破碎20sec/次,3-4次。12000rpm离心20min取上清,即总蛋白。　　 (2)收集细胞,用预冷的PBS洗涤2次,1000rpm/min离心5min弃上清。按照上述方法提取总蛋白。　　 (3)考马斯亮蓝法测定蛋白含量,取90μg总蛋白上样,经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后将蛋白电转移到NC膜上。根据分子量裁膜。5%脱脂奶粉室温封闭1h,加入CXCR6一抗4℃过夜,辣根过氧化酶标记的二抗室温作用1h。每次孵育后均用含5%的Tween-20的TBS洗脱3次,每次5min。待NC膜稍干后,在膜上滴加适量的ECL显影并上机扫描测灰度值。　　 (4)最后,StrongBuffer液洗膜,在加入内参β-actin单克隆抗体(1:1000)孵育,按上述步骤显影并测灰度值,进行统计学分析。　　 五、RT-PCR、电泳&测序　　 以提取并反转录的cDNA为模板,扩增目的基因:25μL反应体系含有Taq酶0.125μL和100ng模板cDNA。反应条件:94℃变性2分钟在经过33个周期94℃变性30秒,58℃/55℃(β-actin)退火30秒,72℃延伸30秒,最后一次延伸10分钟。扩增的产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,UVP凝胶成像检测,检测灰度值进行统计学分析。最后,将PCR产物进行胶回收((QIAGEN试剂盒),然后进行测序。　　 六、ELISA　　 收集胃癌患者血清及细胞培养液上清,经过离心后-80℃保存。购置人CXCL16ELISA试剂盒,按说明书进行CXCL16分泌蛋白的检测。　　 七、MTT比色法测定细胞生长曲线　　 取对数生长期的胃癌细胞AGS和SGC-7901,制成单细胞悬液,以每孔1×105个细胞接种于96孔培养板中,每孔200μL培养液,培养细胞24h。加入浓度CXCL16浓度分别为0μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,150μmol/L,200μmol/L,每组3个复孔,并设空白孔。作用48h后,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μl,37℃继续孵育4h,终止培养。选择490nm波长,酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值,以药物浓度为横轴,细胞增殖比率为纵轴绘制细胞生长曲线。　　 八、细胞侵袭分析　　 在小室滤膜(8um孔径)的内面铺以10ug的ECM胶,4℃冰箱过夜,形成一个基质屏障层。在孔培养板内加入600ul正常培养液。收集上述细胞,重悬于培养基中,终浓度为5×105/ml。将细胞悬液加到上室内,每小室100ul。正常条件培养24h。将小室取出,滤膜用甲醇固定1h。后用吉姆萨染色,显微镜下照相并计数。　　 九、流式细胞术检测细胞周期　　 在含浓度为150μmol/LCXCL16的培养基中,培养上述两种细胞。离心2000r/min,5min,弃上清后加入2mLPBS重复离心一次。用0.5mlPBS重悬细胞至单细胞悬液,并使其迅速在4℃预冷的75%的乙醇溶液中固定,之后在4℃下离心2000r/min,5min,弃上清后加入5mL冷PBS再离心一次,弃去上清。在避光条件下加入1mLPI染液重悬细胞至单细胞悬液,室温孵育30min,用流式细胞仪分析样品。　　 结果：　　 一、OXOL16、CXOR6在胃癌细胞系中的表达　　 通过RT-PCR筛选,我们发现CXCL16和CXCR6在九种胃癌细胞系中均有表达,且表达水平相似。　　 二、CXCR6在组织中的蛋白表达水平　　 在27例胃癌新鲜组织及对应正常粘膜中检测蛋白水平,发现17例(63.O%)癌组织高于正常,5例(18.5%)低于正常,5例(18.5%)无差别。经过统计学分析显示,在蛋白水平癌组织和正常粘膜的CXCR6表达有显著差别。　　 三、CXCL16和CXCR6在组织中的mRNA表达水平　　 在28例胃癌新鲜组织及对应正常粘膜中检测CXCL16和CXCR6mRNA表达水平。CXCL16的结果显示,18例(64.3%)癌组织高于正常,3例低于正常,7例无差别;而CXCR6的结果显示,6例癌组织高于正常,18例(64.3%)低于正常,4例无差别。经过统计学分析显示,CXCL16mRNA水平癌组织高于正常粘膜的表达,结果有显著差别,而CXCR6mRNA水平癌组织低于正常粘膜的表达,结果也有统计学意义。　　 四、胃癌患者血清及细胞上清中CXCL16含量的检测　　 我们将胃癌患者的血清按说明书步骤加入ELISA试剂盒并进行检测,结果与患者的临床病理学指标进行统计学分,结果显示,患者血清中CXCL16的分泌与患者的年龄、淋巴管浸润和Lauren分型相关(P＜0.05)。　　 之前经过筛选,CXCL16在每种胃癌细胞系中都有表达,我们选择两种细胞AGS和SGC-7901,通过ELISA的方法检测CXCL16在IL-1β和TNFα诱导下的分泌情况。结果显示,IL-1β和TNFα均能显著提高两种细胞分泌CXCL16的量,并且呈现浓度依赖方式,即随IL-1β和TNFα浓度的增加,CXCL16分泌的浓度也逐渐增加。　　 五、MTT比色法测定细胞生长曲线　　 MTT结果显示随着CXCL16浓度加大,两种细胞的活力均逐渐增加,而且呈现浓度依赖方式。　　 六、流式细胞术检测细胞凋亡　　 AGS和7901随CXCL16的浓度增加,凋亡逐渐减少　　 七、细胞侵袭分析　　 AGS和7901随CXCL16的浓度增加,侵袭力逐渐增加(P＜0.05)。　　 八、流式细胞术检测细胞周期　　 流式细胞术检测细胞周期,结果显示两种细胞随着CXCL16浓度的增加,G2期细胞比例逐渐增加。　　 结论：　　 1.CXCL16/CXCR6与胃癌的侵袭、转移相关,而且影响胃癌细胞的生物学行为;　　 2.许多细胞因子如IL-1β、TNFα影响CXCL16的分泌,从而促进癌细胞的侵袭和转移;　　 3.CXCL16/CXCR6与其他趋化因子共同作用,影响肿瘤的进展,但是其分子机制尚需进一步研究。