系统性红斑狼疮(SLE)是严重危害人类健康的自身免疫性疾病,其病变特征是患者血清中含有多种致病性的抗核抗体(ANA),以及由此造成的免疫复合物沉积和最终的多个靶器官损伤。但是,SLE作为典型的、复杂的自身免疫性疾病,多年来其病因及发病机制并未得到明确结论,也一直是学者们研究的热点。近几年来,越来越多的研究提示B淋巴细胞在SLE发病过程发挥重要作用。SLE患者外周血B细胞表面抑制性受体FcR下调、B细胞存活因子BAFF的水平上升,造成患者体内B细胞过强并且持久的活化；MRL/lpr小鼠的狼疮样反应在B细胞缺陷时有明显缓解；采用去除B细胞的药物治疗临床SLE病人取得显著疗效,更是为B细胞在疾病发生过程中所起的关键性作用提供了直接证据。我们实验室在长期关于SLE发病机制的研究中发现,活化诱导凋亡的淋巴细胞来源的DNA(凋亡DNA, apoptotic DNA)免疫同系BALB/c小鼠能诱导高水平抗双链DNA抗体的产生；且抗双链DNA抗体具有致病性,介导免疫小鼠狼疮肾炎的发生。而在相同条件下,正常淋巴细胞来源的DNA(正常DNA, normal DNA)却不能刺激小鼠产生抗体以及SLE样自身免疫病发生。但是,凋亡DNA如何诱导同系小鼠B细胞产生抗双链DNA抗体?B细胞除了具有特异性识别抗原的BCR,而且表达Toll样识别受体(Toll like receptor),Toll样识别受体中的核酸受体如TLR9、TLR7等在自身免疫病中的作用逐渐得到人们重视,如抗体的生成、细胞的活化以及靶器官的损害等等。那么TLR9是否直接参与了B细胞抗体的产生呢?而B细胞除了具有抗体分泌功能,在自身免疫反应中的免疫辅助作用也逐渐被重视,研究提示B淋巴细胞在SLE的发病中,不仅仅是通过产生多种自身抗体的作用(autoantibody-dependent roles),而且发挥抗体非依赖的功能(autoantibody independent roles).那么其是否参与凋亡DNA诱导CD4+T细胞的活化呢?B细胞同时具有两方面作用对于疾病的发生有何意义?基于此,我们首先建立了小鼠SLE样综合征模型,在此基础上深入研究B淋巴细胞在凋亡DNA致病过程中的作用,为进一步理解SLE的发病机制提供一定的实验依据和理论基础。第一部分：B细胞通过TLR9识别受体增强凋亡DNA诱导其产生抗双链DNA抗体能力我们实验室长期对SLE发病机制的研究发现,与正常淋巴细胞来源的DNA(normal DNA)相比,以ConA活化6天后诱导凋亡的的淋巴细胞来源的DNA(apoptotic DNA)免疫小鼠可诱导SLE样综合征。因此,我们以凋亡DNA免疫同系BALB/c小鼠,在其体内诱导产生较高水平的抗双链DNA抗体,并成功建立了小鼠SLE样自身免疫病模型。那么B细胞作为产生抗双链DNA抗体的唯一细胞,如何参与抗双链DNA抗体产生,特别是研究TLR9如何直接参与B细胞在SLE小鼠发病过程中的作用,成为我们关注的焦点问题。因此,我们首先检测了各免疫组小鼠脾脏B细胞的变化,选择模型抗体诱导生成水平达到稳定的时间点,即免疫后第8周作为观察的时间点。结果发现：与正常DNA免疫组相比较,凋亡DNA免疫小鼠脾脏的B细胞比例和数量增加；进一步分析在凋亡DNA诱导抗体生成过程中B细胞TLR9的表达变化发现,凋亡DNA免疫小鼠来源的B细胞,经RT-PCR、Real-time-PCR以及流式方法检测后均发现,其Toll样受体9表达水平明显升高；提示B细胞TLR9可能与其产生抗双链DNA抗体相关。为此,我们用TLR9信号通路抑制剂氯喹,联合凋亡DNA共同免疫小鼠,发现体内抗双链DNA抗体水平降低；凋亡DNA对小鼠体内B细胞TLR9的诱导表达水平降低。考虑到体内环境的复杂性以及其他表达TLR9受体细胞的影响,体外直接观察B细胞表达TLR9对其生成抗双链DNA抗体的作用。仅凋亡DNA能诱导其免疫小鼠脾脏细胞在体外产生抗双链DNA抗体,利用这一体外抗体诱导方法,分选凋亡DNA免疫小鼠来源的B细胞,经氯喹预处理后,再和去除B细胞的其他同一来源的淋巴细胞混合,在凋亡DNA体外刺激下观察抗体的生成。结果显示,氯喹单独作用B细胞后,凋亡DNA体外诱导抗体生成能力减弱。以上结果提示凋亡DNA可诱导性上调小鼠B细胞TLR9表达水平,B细胞通过TLR9识别受体增强凋亡DNA诱导其产生抗双链DNA能力,在SLE的致病过程中有重要意义。第二部分：B细胞通过活化CD4+T细胞形成自我调节环路增强其产生抗双链DNA抗体能力目前大量的研究提示,B细胞不仅仅通过分泌自身抗体参与SLE等自身免疫病的发生,而且在自身抗原提呈、T细胞的活化和极化以及炎性因子释放等方面起到重要的抗体非依赖作用。体内自身抗体的持续高水平介导SLE疾病的进行性加重,那么B细胞同时发挥抗体非依赖功能,特别是辅助T细胞活化的作用,形成B细胞到T细胞再到B细胞的自我调节环路,对于自身抗体的产生和疾病的后续发展就更有意义。为此,我们进一步探讨凋亡DNA免疫小鼠B细胞和T细胞活化的相互作用环路。我们首先观察凋亡DNA诱导抗双链DNA抗体产生是否需要T细胞辅助。结果表明,凋亡DNA不能诱导裸鼠产生抗双链DNA抗体,去除CD4+T细胞显著下调凋亡DNA体外诱导抗双链DNA抗体的产生,凋亡DNA诱导B细胞抗体生成是CD4+T细胞依赖的。进一步观察B细胞对凋亡DNA刺激CD4+T细胞的辅助作用,结果发现,经凋亡DNA免疫后的B细胞可以有效辅助CD4+T细胞的活化增殖,正常DNA免疫小鼠来源的B细胞不能发挥这一作用。为进一步研究B细胞辅助CD4+T细胞的作用机制,首先用Trans-well实验发现B细胞主要通过细胞-细胞接触方式活化CD4+T细胞。APC膜表面共刺激分子包括CD28/B7、CD154/CD40、LFA-1/ICAM-1等是T细胞活化的重要信号,其中在自身免疫病的研究中提示CD28/B7信号分子对T细胞的反应性有重要作用。我们检测了B细胞表面的协同刺激分子CD80/CD86的表达,发现经凋亡DNA免疫后小鼠B细胞CD80/CD86表达上调,而CD86阻断抗体可以抑制B细胞对CD4+T细胞的活化作用。在第一部分研究中发现,两种不同来源B细胞TLR9表达水平是有差异的,那么TLR9是否参与B细胞辅助CD4+T细胞的作用呢?我们观察用氯喹预处理B细胞后对CD4+T细胞的活化作用,结果发现,氯喹处理组较未处理组B细胞辅助CD4+T细胞的作用明显降低,且氯喹处理组B细胞CD80/86表达下降。提示B细胞经凋亡DNA诱导高表达TLR9的信号作用,上调其细胞表面CD80/86分子,有效辅助CD4+T细胞活化,进而通过活化的CD4+T细胞形成自我调节环路增强其产生抗双链DNA能力。综上所述,我们在凋亡DNA免疫同系小鼠成功建立SLE样综合征模型的基础上,研究提示凋亡DNA诱导小鼠B细胞TLR9表达水平升高；B细胞通过上调表达的TLR9信号作用增强其抗双链DNA抗体生成水平,同时活化CD4+T细胞以利于其抗体的持续产生能力。综合结果用示意图表示如下：