论文部分内容阅读
目的观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对人胃癌细胞株AGS发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)及体外侵袭的影响。方法1.将体外正常条件下培养的AGS细胞用10ng／ml TGF-β1干预,连续培养3代以后,倒置显微镜下观察细胞形态学的变化。2.分别以1、2、5、10、20、50ng／ml六组终浓度的TGF-β1作用于AGS细胞,同时设立空白对照组,连续培养24小时后,MTT比色法检测TGF-β1对AGS细胞增殖的影响。3.待体外培养的AGS细胞长到完全融合时,用200μl微量移液枪头在单层细胞上垂直划痕,之后实验组中加入终浓度为10ng/ml的TGF-β1,每24小时于倒置显微镜下观察划痕愈合程度,并与对照组进行比较。4.应用24孔Transwell侵袭小室进行AGS细胞侵袭试验,于实验组中加入终浓度为10ng／ml的TGF-β1,对照组加入等量PBS作为趋化剂,连续培养24小时,培养结束后取出Transwell侵袭小室,以4%冰多聚甲醛固定,苏木素染色,高倍镜下计数膜背面上的穿膜细胞数,与对照组相比较,检测细胞运动和侵袭能力的改变。5.将对数生长期的AGS细胞制备细胞爬片,实验组加入终浓度为10ng／ml的TGF-β1,48小时后以细胞免疫荧光方法检测核转录因子snail、上皮细胞标志蛋白E-cadherin和间质细胞标志蛋白N-cadherin表达的变化。6.同时以终浓度为10ng/ml的TGF-β1作用于AGS细胞48小时后,应用Western blot检测实验组与对照组中,Snail、E-cadherin和N-cadherin表达的变化。1.AGS细胞形态上的改变：TGF-β1诱导AGS向间充质细胞形态转化,细胞失去上皮细胞的多边样形态,表现为类似成纤维细胞,部分细胞呈梭形,细胞的排列较为杂乱,细胞间的联系较为松散。2.MTT比色法结果：1、2、5、10ng／ml低浓度的TGF-β1可促进细胞增殖,并且细胞增殖与TGF-β1的浓度成线性关系,随着浓度的增大,细胞增殖越明显,且TGF-β1浓度为10ng／ml时促进细胞增殖的作用最强,而20、50ng/ml高浓度的TGF-β1时细胞增殖比率逐步下降。3.细胞划痕试验结果：划痕后,与对照组相比,加入10ng/ml TGF-β1继续培养的实验组,细胞迁移能力明显增强。4. Transwell侵袭实验结果：Transwell小室培养细胞24h后,AGS细胞穿膜细胞数为58.33±5.859,实验组穿膜细胞数为105.67±4.041,两者相比差异具有显著性(p<0.05),表示AGS细胞运动和侵袭能力较对照组大大增强。5.免疫荧光检测snail、E-cdaherin和N-cadherin的表达：兔抗人Snail(1：800)加入AGS细胞,加入特异性山羊抗兔IgG(H+L)/FITC二抗后,荧光显微镜下观察,发现AGS细胞核呈现绿色荧光,加入10ng/ml TGF-β1的实验组与对照组相比较,绿色荧光表达更强。鼠抗N-cadherin单克隆抗体加入AGS细胞,加入山羊抗小鼠IgG(H+L)/TRITC标记的荧光二抗后,荧光显微镜下观察,发现AGS细胞质呈现红色荧光,加入10ng／ml TGF-β1的实验组与对照组相比较,红色荧光表达更强。鼠抗E-cadherin单克隆抗体加入AGS细胞,加入山羊抗小鼠IgG(H+L)/TRITC标记的荧光二抗后,荧光显微镜下观察,未检测出红色荧光的表达,加入10ng／ml TGF-β1的实验组亦未检测出红色荧光的表达。6. Western blot实验结果：10ng／ml TGF-β1作用于AGS细胞后,Snail和N-cadherin的表达较对照组增多,而E-cdaherin本身表达微弱,加入TGF-β1后,E-cadherin表达减少,更加微弱。结论TGF-β1可以诱导AGS细胞发生EMT,增加其侵袭、转移的能力。