论文部分内容阅读
新型鸭呼肠孤病毒(New-type duck reovirus,NDRV)病为一种新发疫病,其病变特征主要表现为肝脏不规则坏死、斑块状出血和心肌、法氏囊出血等。该病发病率和病死率虽然差别较大,但患病鸭日龄愈小,发病率、病死率愈高。自2005年以来,该病由福建、广东及浙江等地向其它地域蔓延并传播迅速,导致养鸭业的经济发展严重受损。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型核酸扩增技术,该技术主要利用靶序列6~8个特定位点获得4~6种特异性引物,在Bst聚合酶参与及固定温度下,一般在30~60 min内就能结束链置换扩增反应。逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术在LAMP技术基础上加入反转录酶,一步完成全部反应。该技术具有强特异性、高敏感性、快速及所需仪器设备简单等优点。本论文针对NDRV检测技术进展及临床检测需要,以NDRV-QY为研究对象,根据GenBank中注册的NDRVσB蛋白基因序列,采用LAMP在线引物设计软件及Primer–BLAST、Oligo 7.0和Larsergene 7.0 PrimerSelect进行引物设计及筛选。采用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得σB蛋白基因序列,连接PMD18-T载体,成功构建重组阳性质粒,并测序得到全长1 104 bp。结合本研究设计的6种特异性引物,将RT-LAMP技术同钙黄绿素相结合,建立了NDRV可视化RT-LAMP快速检测方法,并对反应条件进行优化;同时,将RT-LAMP技术与核酸试纸条技术相结合,建立了NDRV RT-LAMP核酸试纸条快速检测方法。并采用两种方法对疑似新型鸭呼肠孤病临床病料进行检测。研究结果表明,所建两种RT-LAMP检测方法特异性强,且能在65℃条件下50 min内完成反应,能最低检测出200 fg的NDRV RNA及阳性质粒,比传统RT-PCR敏感100倍。对15份临床疑似混合病料的检测中,新建的两种检测方法与RT-PCR阳性检测率相同。对12份临床疑似病料进行检测中,新建的两种方法阳性检测率高于RT-PCR。对健康雏番鸭进行NDRV尿囊液攻毒后检测,结果显示两种RT-LAMP快速检测方法比常规RT-PCR方法的阳性检出率高10.71%,能从腹腔攻毒48 h后小鸭粪便中检测出NDRV。本研究针对NDRV建立的RT-LAMP钙黄绿素可视化方法及其核酸试纸条方法具有比常规RT-PCR方法更加特异敏感、快速简便等优势,为新型鸭呼肠孤病的早期诊断及疫情监测提供重要技术支持,适合于基层及现场的推广使用。