论文部分内容阅读
目的:人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是属于β疱疹病毒亚家族中的一员,是一种线性双链DNA病毒。它可以诱导肿瘤细胞恶性转化,抑制肿瘤细胞凋亡。IE86是由HCMV编码的主要即刻早期调控蛋白,是一种重要的反式激活因子,在HCMV复制中发挥着关键的作用,并与许多疾病的发病机制有着密切的联系。但是,IE86是否在诱导肿瘤细胞的恶性转化和抑制肿瘤细胞凋亡这一过程中发挥关键的作用仍然是未知的。神经胶质瘤是成人当中最常见的颅内肿瘤,其浸润性、侵袭性极强,并且具有治疗后易复发,预后差的特点。细胞蛋白p53为肿瘤抑制基因产物和细胞周期抑制剂。研究表明p53蛋白可调节各种基因的转录,包括涉及细胞周期调控,DNA修复和程序性细胞死亡。p53蛋白可以活化p21蛋白,并将p21蛋白充当介质以抑制细胞分化和增殖。因此推测:IE86蛋白可通过p53信号通路对恶性神经胶质瘤细胞凋亡产生影响。然而,由于HCMV存在物种特异性,之前对其IE86蛋白的研究只局限于细胞及分子水平。本研究旨在通过动物水平,在体内探究IE86对基因修饰荷胶质瘤小鼠p53表达水平及恶性胶质瘤细胞凋亡情况的影响。方法:首先,通过PCR技术对基因修饰小鼠IE86表达情况进行鉴定。依据鉴定结果将小鼠分为四组,每组各12只,分别是IE86阳性肿瘤组织组、IE86阴性肿瘤组织组、IE86阳性脑组织组、IE86阴性脑组织组。然后,将小鼠神经胶质瘤UL261细胞传代培养以制备细胞密度为3×10 ~7个/mL的单细胞悬液。在IE86阳性肿瘤组织组、IE86阴性肿瘤组织组小鼠的右侧腋下接种0.1mL已制备好的单细胞悬液,另外两组在相同部位接种0.1mLPBS。接种胶质瘤细胞后,连续观察IE86对肿瘤生长及小鼠存活情况的影响,待荷瘤成功后,处死小鼠后分别取出肿瘤组织和脑组织。统计分析IE86对肿瘤生长状况的影响,应用HE染色来观察肿瘤形态结构特点。利用实时定量PCR的技术检测IE86和p53mRNA表达水平变化。免疫组织化学方法检测p53受体的表达水平。分别用Western blot和免疫组织化学方法分析了p21受体的表达水平情况。TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况。结果:PCR结果显示,成功构建了IE86基因修饰小鼠模型并且荷瘤成功;实时定量PCR与免疫组织化学结果显示,与IE86阴性组相比IE86阳性组p53表达水平上升(*P<0.05),同时Western blot和免疫组织化学方法显示,IE86阳性组p21表达水平下降(*P<0.05);TUNEL检测结果显示,IE86阳性组细胞抗凋亡能力增强(*P<0.05)。以上结果表明,在基因修饰的小鼠中IE86持续表达但p53转录活性的指示标志p21下调,且IE86可提高恶性胶质瘤细胞抗凋亡能力。结论:本研究中IE86基因修饰荷胶质瘤小鼠模型的成功建立,克服了HCMV物种特异性的局限,首次实现从动物水平上探究IE86对恶性胶质瘤细胞凋亡的影响,这有利于阐明IE86蛋白在维持病毒感染中的作用,为恶性神经胶质瘤细胞凋亡相关分子机制提供理论基础。