DNA是主要遗传信息的载体和调控者。随着多学科的交叉发展,DNA分子不仅仅是具有信息储存功能的载体,DNA的其他功能的也被发现。通过特定的筛选过程,人们可以得到一些具有特殊功能的核酸分子,这类核酸称为功能核酸。功能核酸主要可以分为两大类:一类是类似于抗原抗体具有识别功能的核酸分子,能结合特定的目标物,这类DNA或者RNA称为核酸适配体(Aptamer);另一类是类似于某些酶,可以催化一些反应的发生,这类DNA或者RNA称为核酶(DNAzyme/RNAzyme)。功能核酸的发现扩展了人们对于核酸的认识,也为科研工作者提供了新型的分子工具。功能核酸的本质是DNA或者RNA,相比于蛋白质本质的抗体或者酶,合成方法可控,操作简单,并且化学性质稳定,不易失活,没有不同生产批次活性不同的影响。近年来,多种基于功能核酸的分析方法被开发应用于各种生化分析,因其良好的生物相容性和可以识别并结合特定分子的性质,也被应用于生物成像和癌症的治疗。功能核酸在行使其功能时,都会形成特定的二级或者三级结构,以适应某种目标物的结合或者催化活性区域的产生。具有过氧化物酶活性的DNAzyme是分析化学中常用的功能核酸分子之一,这种DNAzyme是由鸟嘌呤四链体及hemin构成,因其可以催化底物产生颜色变化而广泛应用于各种目标物的分析。当前这种DNAzyme的研究多集中于已知固定序列的鸟嘌呤四链体,随机序列研究很少,我们主要研究了随机排列富含鸟嘌呤序列的合成新方法和相关应用。具体内容如下:1.随机排列鸟嘌呤四链体的合成新方法本章利用一种无需模板的末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,Td T),来获得随机排列的富含鸟嘌呤的长链DNA。对获取的长链DNA的性质进行考察,发现当这种富含鸟嘌呤的随机排列的DNA与hemin结合后,与一般固定序列的DNAzyme有类似的催化活性。选取三种比例的底物组成,分别考察Td T延伸的产物DNA长度,结构,和DNAzyme活性。其中当d GTP:d ATP=6:4时,所获得的Td T延伸产物与hemin形成复合物具有的DNAzyme活性最高。并且,这种随机排列富含鸟嘌呤的DNA可以与特异性结合鸟嘌呤四链体的荧光染料硫磺素T(Thioflavine T,Th T)结合,结合后大大增强Th T的荧光。我们证明了这种随机排列的富含鸟嘌呤的DNA可以形成鸟嘌呤四链体结构,并且具有高效的DNAzyme活性和特异性结合荧光染料的性质,扩大了对于鸟嘌呤四链体的认识,提供了产生鸟嘌呤四链体的新方法。2.随机排列鸟嘌呤四链体在生物分析中的应用基于上一章对于tdt生成的鸟嘌呤四链体的研究,我们开发了一些基于随机排列的鸟嘌呤四链体在生物分析中的应用,主要分析对象有目标dna,蛋白质,和酶。相比于传统的基于dnazyme作为信号输出的方法,基于tdt方法生成的鸟嘌呤四链体不需要在体系中引入含有dnazyme的序列,避免预先存在的dnazyme带来的背景信号。首先,我们开发了一种无标记检测tdt酶活性的方法,因为背景信号低,tdt聚合产生的dna形成的dnazyme具有较高活性,此方法具有很高的信背比,为实现低浓度无标记检测tdt提供了有效方法,检测限可以达到0.0394u(s/n=3)。其次,由于tdt产生的随机排列的鸟嘌呤四链体结合染料tht的速度非常快,十秒内可以达到平衡,利用这个性质可以实现tdt的实时监测,这也是对tdt实时检测的首次报道。该方法也可以应用于实际样品中的tdt检测,我们在10%的人血清中进行了测试,证明此方法有潜力应用于临床诊断。目标dna的检测,是通过内切酶辅助的信号放大方法(nesa)与tdt产生的dnazyme联用。先将信号探针3’端用磷酸基团封闭,当有目标dna存在时,内切酶识别信号探针与目标dna形成的双链结构对信号探针进行切割,释放出含有3’-oh的小片段作为tdt延伸引物,目标dna从双链结构上脱落进入下一轮循环。目标蛋白质(凝血酶)的检测,是通过构建含有识别凝血酶核酸适配体序列和限制性内切酶识别序列形成的封闭发夹结构,当有凝血酶存在时,由于核酸适配体的识别作用打开发夹,释放出与信号探针互补的区域,引起nesa过程,从而实现目标蛋白的检测。生化分析中的常见目标dna,蛋白质和酶的成功检测,表明tdt产生的随机排列富含鸟嘌呤四链体在生物分析中有普遍的适用性。3.随机排列鸟嘌呤四链体用于凋亡细胞的检测基于前面章节tdt可以在最优比例dntp条件下聚合产生可以形成鸟嘌呤四链体dna的方法,我们开发了一种基于随机排列鸟嘌呤四链体用于凋亡细胞检测的方法。凋亡过程中细胞的基因组dna会断裂成180-200bp的小片段,通过对这些含有缺口的小片段dna检测可以反映细胞的凋亡情况。基于随机排列鸟嘌呤四链体的方法可以实现原位免标记检测凋亡细胞。首先,我们基于随机排列鸟嘌呤四链体实现低浓度单链dna的检测。然后对质粒dna和hela细胞的基因组dna,利用dnasei酶切处理,再用tdt延伸的方法实现了大分子dna的检测。基于以上实验基础,我们开发了一种基于tdt产生鸟嘌呤四链体原位检测凋亡细胞的方法。并且,此方法与传统的流式细胞仪定量法和凝胶电泳法取得了一致的结果。4.超电荷绿色荧光蛋白与g4/hemin复合物的相互作用的研究与应用我们首次发现g4/hemin复合物可以淬灭超电荷绿色荧光蛋白的荧光,而单独的hemin或者hemin与非g4结构的dna不能淬灭超电荷绿色蛋白的荧光。为了进一步理解淬灭过程,我们开展了一系列的实验来探讨其淬灭机理。通过对荧光蛋白的发射光谱与G4/hemin复合物吸收光谱的比较,hemin浓度对蛋白荧光强度的影响,以及在荧光蛋白加入G4/hemin复合物前后的荧光寿命的变化,我们的结论是这种淬灭现象是由于光致电子转移引起。利用这种现象,可以设计荧光信号开关来实现目标物的检测,我们构建了基于超电荷绿色荧光蛋白与G4/hemin复合物相互作用的肝素和Tb3+分析体系。