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【目的】MicroRNA(miRNA)是真核细胞中广泛存在的长约22nt的高度保守的单链非编码RNA分子,一般在转录后水平下调基因的表达。越来越多的证据表明,miRNA可以激活转录或翻译。RNA结合蛋白(RBPs)作为基因表达的通用调节子,影响pre-mRNA的剪切,成熟mRNA的转运,定位,代谢和翻译。RBPs可以通过直接或间接与miRNA相互作用,协同或竞争性地调控特定mRNA的表达。我们前期发现GRSF1结合miR-346的特定模序“CCGCAU”,而其侧翼序列与hTERT 3′UTR结合形成GRSF1-miR-346/hTERT mRNA复合物并促进其募集到核糖体上,从而增加hTERT的表达。本文旨在探讨GRSF1介导miR-346结合靶基因3′UTR上调其表达的详细调控分子机制。【方法】首先,我们通过Flag亲和纯化技术结合质谱分析筛选GRSF1的相互作用蛋白,查阅大量文献后初步确定可能与GRSF1功能相关的候选蛋白;通过免疫共沉淀实验和免疫荧光实验结合激光共聚焦显微镜分析候选蛋白与GRSF1是否存在相互作用和共定位。接着,我们构建了一系列KIF11,RPS2,Ago2,TRIM21蛋白的截短质粒,通过免疫共沉淀实验确定这四个蛋白与GRSF1结合的具体结构域;通过Western blot实验、RT-qPCR实验检测KIF11,RPS2,TRIM21对hTERT表达的影响。通过RNA免疫共沉淀分析KIF11与hTERT mRNA的结合情况;通过蔗糖密度梯度离心实验检测KIF11对hTERT mRNA在核糖体中的分布的影响。通过Western blot实验、免疫荧光实验检测GRSF1对RPS2在细胞内分布的影响,以及miR-346对GRSF1与RPS2或Ago2共定位的影响;通过RNA免疫共沉淀实验分析GRSF1对Ago2装载的hTERT mRNA量的影响。用放线菌酮处理细胞后,通过Western blot实验检测TRIM21对GRSF1半衰期的影响;我们通过泛素化蛋白免疫共沉淀实验研究蛋白酶体抑制剂MG132处理后,TRIM21对GRSF1的泛素化水平的影响。【结果】GRSF1与KIF11,RPS2,TRIM21,Ago2存在相互作用并在细胞质中共定位,且GRSF1与RPS2也在细胞核中共定位。KIF11和RPS2促进hTERT的表达,而TRIM21抑制hTERT的表达,它们对hTERT表达的影响依赖miR-346的存在以及它们与GRSF1的相互作用。KIF11以GRSF1依赖的方式与hTERT mRNA的结合。KIF11促进hTERT mRNA转运至多聚核糖体,这依赖于KIF11的运动活性及微管结构的完整性,干扰GRSF1-KIF11的体内相互作用减弱了KIF11对hTERT mRNA转运的作用。RPS2并不影响GRSF1的表达水平,但GRSF1在转录后水平上调RPS2的表达,且能促进RPS2从细胞核向细胞质转运。miR-346高表达时GRSF1与RPS2的共定位程度增加,而与Ago2的共定位程度减少。GRSF1抑制Ago2装载miR-138及hTERT mRNA。GRSF1并不影响TRIM21的表达,但TRIM21依赖其E3泛素连接酶活性促进GRSF1的泛素化,使其稳定性下降,从而在转录后水平下调GRSF1的表达。【结论】我们发现GRSF1依赖KIF11将GRSF1-miR-346/hTERT mRNA复合物运输至核糖体,从而促进hTERT的翻译。GRSF1通过在转录后水平上调RPS2的表达,并促进RPS2由细胞核转运至细胞质,选择性地促进hTERT的翻译。GRSF1竞争性地抑制Ago2将miR-138及hTERT mRNA组装到RISC复合体,从而抑制miR-138对hTERT的下调。此外,TRIM21作为GRSF1的泛素化酶,通过调节GRSF1的稳定性,抑制GRSF1介导的miR-346对hTERT的上调。