新型细胞系的开发或基因组测序工作中,生物材料的获取是实验的关键,但由于企业保密性及特定国家海关规定等,一些样本获取会比较困难。无法继续获取具有参考价值的生物材料,会阻碍下一步研究的进行,也影响其对第三方的参考价值。例如,太平洋牡蛎广泛分布于亚洲、澳大利亚和北美的太平洋沿岸,但单个太平洋牡蛎标本在遗传上具有多样性,不适合直接用作建立基因库的起始材料。在本文中,我们使用不同区域养殖的太平洋牡蛎作为样本,生成cDNA文库。以线粒体管家基因细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COX1）和NADH脱氢酶（ND）为参考,将得到的cDNA文库与公开基因库中的太平洋牡蛎基因组进行比较,选择最接近的文库,再用UDP-葡萄糖异构酶（UGE）、UDP-葡萄糖脱氢酶（UGD）、UDP-木糖合成酶（UXS）三种细胞核基因检验所选cDNA文库的准确性。唾液酸是一种出现在糖苷化合物末端的九碳糖,参与细胞和细胞、细胞与分子之间的识别,其合成与分解一直是研究的热点。N-乙酰神经氨酸醛缩酶（NPL）能催化N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）裂解成N-乙酰-甘露糖胺（ManNAc）和丙酮酸,是唾液酸循环的关键酶之一,这种酶一般出现在需要分解唾液酸的生物中。牡蛎的肝胰腺中发现了几种唾液酸水解酶,但一直没有关于唾液酸醛缩酶的报道。因此,我们拟从太平洋牡蛎中克隆疑似 N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因,进行原核异源表达,并与人源的N-乙酰神经氨酸醛缩酶进行比较,推测其在牡蛎中的功能。最终,我们从太平洋牡蛎随机样本中筛选与NCBI基因组数据库参考序列最相似的样本,构建了 cDNA文库并克隆、表达了 N-乙酰神经氨酸醛缩酶,对其底物特异性进行了初步研究,发现其对KDO、KDN及其类似物具有活性,酶活位点是Lys174。具体研究成果如下:1.太平洋牡蛎cDNA文库的筛选选取有地域差异的牡蛎样品-辽宁丹东、山东青岛、江苏连云港、浙江宁波、福建东山岛、广东潮州。用TRIZOL法提取六种牡蛎中的RNA,反转录生成cDNA。设计引物克隆COXI、ND、UXS、UGE、UGD基因。COXI、ND测序结果表明除浙江样品的差异稍大,其他省份的样品的同源性都很高,辽宁和江苏的样品两个基因的相似度都达到了 100%。然后用细胞核基因UGE、UGD和UXS对所选进行检验,结果显示也是除了浙江省的样品外,相似度都在97.5%以上。因此,辽宁、江苏的cDNA文库可以用来作为克隆后续基因的模板。选取江苏cDNA为模板,成功克隆出了太平洋牡蛎的半乳糖激酶和N-乙酰氨基半乳糖激酶,其中N-乙酰氨基半乳糖激酶对N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰-D-甘露糖胺和N-乙酰半乳糖胺有较强活性。2.牡蛎中唾液酸醛缩酶的克隆表达及E.coli BL21菌株的改造以大肠杆菌唾液酸醛缩酶（EcNPL）基因为参考,在NCBI网站中检索到太平洋牡蛎中有4种疑似NPL序列。以前一章获得的江苏cDNA为模板克隆得到了 CgNPL-2、CgNPL-3和CgNPL-4,测序结果表明克隆的基因只有少量的氨基酸变异点。CgNPL-3、CgNPL-4在E.coli BL21中表达时,生成的是包涵体蛋白。CgNPL-1无法用克隆的方式获取,因此由生物公司合成,经E.coli BL21异源表达后,得到可溶性的酶,经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后仍有较多杂蛋白。CgNPL-1以Neu5Ac为底物进行酶活验证时,只有少数情况下有产物生成,推测可能是大肠杆菌本身表达的NPL影响了活性验证的结果。因此使用双质粒CRISPR/Cas9技术来敲除大肠杆菌中NPL基因,经PCR法、Neu5Ac诱导法验证,大肠杆菌NPL基因敲除成功。将CgNPL-3导入敲除NPL基因的BL21中,该蛋白能够成功表达,说明NPL基因的敲除对BL21的蛋白表达能力没有显著影响。3.重组唾液酸醛缩酶酶的活性检测通过生物公司合成人源的N-乙酰神经氨酸醛缩酶（HsNPL）。对CgNPL-1氨基酸序列进行分析后得知,其Lys174可能是其活性位点,利用PCR法将该位点突变成丙氨酸。将HsNPL、CgNPL-1、突变后的CgNPL-1质粒导入敲除唾液酸醛缩酶基因的E.coli BL21中,Ni2+-NTA亲和层析柱去除大部分杂蛋白,以Neu5Ac、KDO、去氨基神经氨酸（KDN）及其类似物为底物,验证三种酶的活性。结果表明不同于HsNPL,CgNPL-1对Neu5Ac没有活性,但对KDO、KDN以及KDN类似物有活性。突变后的CgNPL-1活性消失,说明Lys174是其活性中心。