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本研究应用蛋白质组学方法,采用二维色谱和质谱联合应用技术,对直肠癌与癌旁组织进行分析,得到差异表达蛋白35个。通过多种参数分析及查阅大量文献最终选定真核延伸因子2(e EF2)作为本研究的目标蛋白。接下来以e EF2氨基酸序列N端300个氨基酸为目标多肽,通过优化密码子合成目标基因片段,并成功克隆至原核表达载体p ET30a,将重组表达质粒转化感受态细胞,进行融合蛋白的诱导表达,并获得了高纯度的e EF2融合蛋白。以纯化的e EF2融合蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,通过有限稀释法筛选出四株稳定分泌抗人e EF2单克隆抗体的杂交瘤细胞。单克隆抗体效价均达到1:240000以上,亚型均为Ig G型,抗体纯度达90%以上。对四株e EF2单克隆抗体进行配对筛选,选出用于ELISA双抗体夹心的最佳配对抗体,成功建立了e EF2双抗体夹心ELISA检测方法。最后我们应用自建的双抗体夹心ELISA方法检测肿瘤患者血清中e EF2表达情况。本研究分为四部分,主要研究方法及结果如下:第一部分:二维色谱与质谱联合应用分析直肠癌与癌旁组织的差异蛋白方法:1、取20例Dukes B期直肠癌腺癌的癌组织及癌旁组织标本,制备多肽混合物。2、应用二维色谱和质谱技术联合分析癌组织及癌旁组织蛋白谱。3、通过数据分析得到直肠癌与癌旁组织差异表达蛋白。结果:1、癌组织:共获得31618个多肽序列,经整理鉴定得到813个蛋白。2、癌旁组织:共获得23547个多肽序列,经整理鉴定得到537个蛋白。3、经统计分析,共获得癌组织与癌旁组织的差异表达蛋白35个,其中在癌组织中上调表达的蛋白18个,下调表达蛋白17个。4、通过多种参数分析及查阅大量文献最终选定真核延伸因子2(e EF2)作为本研究的目标蛋白。第二部分:e EF2基因的克隆及表达方法:1、分析e EF2蛋白氨基酸序列的抗原表位情况,确定N端300个氨基酸作为目标蛋白,并对密码子进行优化,使其更适合原核系统表达。2、应用基因合成技术对优化后的目的基因进行合成,在上游添加Nde I酶切位点,下游添加Xho I酶切位点。3、将合成的e EF2目的基因片段克隆至原核表达载体p ET30a中,构建原核表达质粒p ET30a-e EF2。4、将重组表达质粒转化E.coli BL21感受态细胞,进行融合蛋白的诱导表达。结果:1、成功构建了原核表达质粒p ET30a-e EF2。2、成功表达并分离、纯化了e EF2融合蛋白。第三部分:e EF2单克隆抗体制备方法:1、免疫小鼠:以弗氏佐剂与纯化的e EF2融合蛋白混合作为免疫原。2、杂交瘤细胞制备:取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。3、杂交瘤细胞筛选:用ELISA方法测定效价,筛选出阳性细胞株。4、用有限稀释法对筛选出的阳性杂交瘤细胞株进行抗体亚型鉴定、建株、冷冻保存。5、小鼠腹水诱导:将阳性杂交瘤细胞株接种于小鼠腹腔制备腹水,检测腹水抗体效价。6、e EF2单克隆抗体纯化,亚型分析及效价检测。7、ELISA双抗体夹心法配对单克隆抗体筛选。结果:1、筛选出四株稳定分泌抗人e EF2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2、单克隆抗体效价均达到1:240000以上,亚型均为Ig G型,抗体纯度达90%以上。3、筛选出最佳的配对单克隆抗体,成功建立用于检测样本中e EF2含量的双抗体夹心ELISA方法。第四部分:e EF2在肿瘤患者血清中的表达方法:1、以自制并筛选配对的e EF2单克隆抗体,用ELISA双抗体夹心法检测多种肿瘤患者血清中e EF2含量。2、通过购买商品化的磷酸化e EF2(p-e EF2)试剂盒检测肿瘤患者血清中p-e EF2含量3、同时检测健康体检人群血清中e EF2及p-e EF2含量,作为正常对照。4、将肿瘤患者分为不同组别,包括治疗前、化疗中等,结合临床资料分析e EF2及p-e EF2的变化规律,判断不同肿瘤及肿瘤不同阶段e EF2的变化规律。5、为了排除因标本留取时间不同对结果产生的影响,将2014年冻存和2015年冻存的标本进行分组比较。结果:1、e EF2在直肠癌治疗前、直肠癌化疗中、结肠癌、肺癌、乳腺癌患者血清中的检测结果与健康对照组比较具有显著差异。2、e EF2在胃癌与对照组、直肠癌治疗前与直肠癌化疗中的比较中则无显著差异。3、p-e EF2在直肠癌治疗前、直肠癌化疗中患者血清中的检测结果与健康对照组比较具有显著差异。4、p-e EF2直肠癌治疗前与直肠癌化疗中的比较中也具有显著差异。5、2014年冻存的标本和2015年冻存的标本进行分组比较,结果显示两组间e EF2及p-e EF2均无显著差异。结论:1、应用质谱技术及蛋白质组学研究,得到了直肠癌与癌旁组织的差异蛋白谱,明确了真核延伸因子2(e EF2)在直肠癌组织中上调表达。2、以N端300个氨基酸为目的片段的e EF2融合蛋白作为免疫原,成功制备了效价和特异性都很好的抗人e EF2单克隆抗体,并建立了e EF2双抗体夹心ELISA检测方法。说明e EF2蛋白N端有多个抗原表位,可诱导产生不同的单克隆抗体,为后续大量制备e EF2单抗指明了方向。3、通过对大量血清标本e EF2及p-e EF2的检测结果分析,我们认为可将e EF2作为肿瘤标志物用于体检肿瘤筛查,p-e EF2可作为敏感指标用于肿瘤治疗过程的监测。