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目的:非编码RNA原被认为是人类基因组中的“暗物质”,新进研究发现其在表观遗传、转录及转录后等多个层面调控基因的表达,进而影响肿瘤的发生和发展。lncRNA LINC00473(LNC473)最近被报道参与调控胃癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤的进展过程。然而,LNC473在大肠癌的生物学特性及作用机制尚不清楚。方法:1、生物信息学:通过对CRC芯片表达谱数据进行聚类分析筛选出显著差异表达的LNC473、hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p、APAF1 mRNA,提取TCGA和GEO数据集进一步比较各指标的的表达并分析APAF1 mRNA与CRC患者预后的相关性;采用KEGG功能富集出LN473共表达mRNA的作用通路并通过聚类分析确定靶基因;使用网络在线平台完成LNC473和APAF1-IRES的二级结构及其与hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p的结合力大小的预测。2、组织样本:基于20对CRC组织样本,采用qPCR和RT-PCR检测LNC473、hsa-miR-574-5p/hsa-miR-15b-5p和APAF1 mRNA表达水平,进一步扩大样本至157对,采用原位杂交和免疫组化法分别检测三个RNAs以及APAF1蛋白的表达情况,同时采用线性回归法分析各指标之间表达的相关性,进一步应用皮尔逊卡方检验、非条件logistic回归分析各指标表达与临床病例参数的相关性,应用Log-rank单因素K-M法及校正多因素COX回归分析各指标表达与CRC患者预后的相关性。3、基础实验:采用qPCR、RT-PCR、蛋白免疫印迹、免疫荧光、CCK8、克隆形成、细胞周期和细胞凋亡等方法比较CRC细胞表型和功能的变化;原位杂交和免疫荧光结合法检测三个RNAs与APAF1蛋白在CRC细胞的共定位。4、机制验证:双荧光素酶报告基因验证hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p与APAF1-IRES结构存在特异性结合序列;RNA pull down实验进一步验证LNC473通过特异序列与hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p直接结合。5、在体实验:采用荷瘤鼠实验在体验证LNC473及APAF1-IRES对CRC细胞增殖作用的影响。结果:1、首先,成对CRC芯片表达谱中LNC473显著低表达,hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p高表达,此结果在TCGA或GEO数据库、6株CRC细胞株及20对CRC组织中进一步得到验证;同时,157对大样本CRC患者组织样本检测结果发现三者主要在胞浆中表达,其在CRC和癌旁的表达差异也进一步得到证实,且LNC473在CRC中的低表达与hsa-miR-574-5p、hsa-miR-15b-5p表达存在显著负相关,并预示CRC患者预后不良。2、其次,为了进一步明确LNC473调控hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p表达与其介导CRC细胞生物学特性的相关性,我们分别过表达、沉默LNC473后,发现hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p表达被负性调控;此外,上调LNC473时,CRC细胞增殖及集落形成能力受到抑制,细胞增殖指数减小,细胞凋亡水平增加;而LNC473下调时,hsa-miR-574-5p、hsa-miR-15b-5p相应的上调,且CRC细胞增殖及集落形成能力增强,细胞增殖指数增加,细胞凋亡水平下降。3、进一步功能富集到LNC473共表达mRNA主要与CRC、核糖体、以及细胞凋亡相关作用通路,并在参与这些通路相关因子中筛选出显著下调的凋亡酶激活因子APAF1,即确定了LNC473/hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p轴的作用靶基因,且APAF1在CRC中的特异性低表达在TCGA数据库、网络在线平台、6株CRC细胞株及20对CRC组织和157对大样本CRC患者组织样本中进一步得到验证;此外,157对大样本,GEO和TCGA数据库数据分析结果均发现APAF1可以显著延长CRC患者预后。4、为了明确LNC473通过hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p正性调控APAF1具体机制,我们首先预测到APAF1-5’UTR区内部核糖体进入位点(IRES)的二级结构且其与hsa-miR-574-5p、hsa-miR-15b-5p存在稳定结合(mfe:25.1kcal/mol和24.2kcal/mol);进一步在293T细胞株中的双荧光素酶报告基因实验结果显示:APAF1-IRES野生型质粒与hsa-miR-574-5p或hsa-miR-15b-5p共转染组荧光素酶表达量显著降低,且hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p协同作用更明显,而APAF1-IRES突变型质粒与hsa-miR-574-5p、hsa-miR-15b-5p共转染组的荧光素酶表达量得到恢复,进一步qPCR结果显示hsa-miR-574-5p、hsa-miR-15b-5p表达水平上调时,APAF1的mRNA水平下降,此结果在HCT116细胞株中得到进一步验证。5、基于RNA和蛋白共定位实验发现LNC473、hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p与APAF1均主要表达于细胞浆;且LNC473可以上调APAF1的mRNA和蛋白表达,并可被hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p翻转;同样预测到LNC473的RNA二级结构及其与hsa-miR-574-5p、hsa-miR-15b-5p存在稳定结合(mfe:38.1kcal/mol和23.2kcal/mol);在293T细胞株中的RNA pull down结果显示:与NC探针相比,LNC473野生型探针与miRNAs共孵育拖拽下来的hsa-miR-574-5p、hsa-miR-15b-5p显著增多;而LNC473突变型探针拖拽下来的hsa-miR-574-5p、hsa-miR-15b-5p数量得到恢复;此外,过表达LNC473后拖拽下来的hsa-miR-574-5p、hsa-miR-15b-5p量均显著减少,此结果在HCT116细胞株中得到进一步验证。6、最后,荷瘤鼠在体实验结果表明APAF1-IRES对CRC细胞增殖的存在抑制作用,且同步过表达LNC473后,前者抑癌作用得到进一步加强。结论:1、LNC473在CRC中的低表达与hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p负相关,其直接作用靶点APAF1显著下调。2、LNC473高表达明显延长了CRC患者的DFS和OS,而hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p表达上调与预后不良显著相关。3、CRC过表达LNC473通过ceRNA竞争性抑制hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p表达,进而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,反之亦然。4、hsa-miR-574-5p和hsa-miR-15b-5p通过特异结合APAF1-5’UTR的IRES依赖翻译起始过程以促进APAF1的翻译过程,该作用可被LNC473翻转。5、裸鼠移植瘤在体验证LNC473通过上调APAF1-IRE活性抑制肿瘤的增殖。