研究背景:胃癌是发病率和恶性水平较高的消化系统恶性肿瘤之一,大部分胃癌患者在早期时没有显著的症状出现,有时会出现上腹不适和食欲不振等症状,常被误认为是普通的胃炎或胃溃疡。随着肿瘤的进展,开始出现浸润和转移,胃癌发展为中晚期,此时治疗方法受限,胃癌复发率高,患者预后较差。此外,胃癌细胞会对化疗药物产生耐药最终导致化疗走向失败,使患者五年生存率降低,高效靶向性药物的匮乏是胃癌治疗的一大障碍。因此为了延长胃癌患者的生存期,对患者的初期诊断、治疗及预后提供新的研究方向,深入探究胃癌发生、发展的分子机制有着重要意义。随着质谱技术的发展,应用蛋白质组学研究疾病的分子机制变得更加广泛。90年代中期,Marc Wilkins最先提出蛋白质组的概念,其不同于基因组的是随着疾病的发生而改变。蛋白质组学在本质上是指在大规模程度上研究蛋白质的特性,比如蛋白质的表达、翻译后修饰变化、蛋白质互作等,能够整体而全面的认识疾病或肿瘤的发生发展等过程。高效液相色谱技术和高分辨质谱技术的发展使蛋白质组学被更广泛的应用到各种疾病中来。人类基因组包含约两万个基因,但是编码的蛋白质数量却还未达成共识,许多蛋白经过翻译后修饰才能行使功能。因此,总蛋白不一定能够代表实际上全部蛋白的功能。人体内发生的蛋白质翻译后修饰种类超过400种,可以分别或多种同时发生于某个特定的氨基酸上,使得人体内蛋白质种类急剧增加,总数超过一亿种。完全揭秘人体内蛋白质的千变万化还需要研究者不断努力。实际测得的相对分子质量与理论基因组序列编码的相对分子质量不同的氨基酸,我们称之为氨基酸多样性。由于蛋白质测序技术通常取决于理论上翻译的蛋白质数据库,普通搜索算法会忽略未定义的氨基酸多样性,目前生物体中的氨基酸残基很少可以直接用蛋白质组学的方式确定。为了寻找解决匹配肽段的方法,最初使用前体与其片段之间的质量差异来检测已知的修饰的Mass-toleran方法,通过Wide-tolerance搜索来匹配未定义的修饰肽段序列。这种非限制性搜索方法能够识别许多已知的修饰和化学改变,通过Ascore定位方法,可以将未知修饰定位到肽段中的特定氨基酸上。不仅可以描述对生物过程具有重要作用的复杂翻译后修饰,而且可以用于鉴定识别稀有的未知修饰和氨基酸替代。本研究通过改进非限制性搜索方法,采用高精度、高分辨率并且快速的数据采集质谱技术,对胃癌患者的癌症组织和癌旁组织的蛋白质表达进行了测定,并且识别实际氨基酸残基与理论编码的氨基酸之间的非零质量差,然后根据这些质量差做高斯混合分布分析以及迭代回归分析,从而确定了 579种高可信度的聚集高斯簇,精确匹配到甲基化、乙酰化和磷酸化等已知修饰,同时也发现了许多可能的未知修饰。采用机器学习算法建立决策树,确定了 2752种高度可信的氨基酸多样性,分布在32,306个蛋白质位点上。此外,还有些氨基酸多样性在胃癌组织和癌旁组织中呈差异性分布,提示这些氨基酸多样性与胃癌发生机制有关,其中有些磷酸化位点的功能已经被研究报道。由于核苷酸多态性、翻译后修饰,以及一些未知的机制,氨基酸多样性广泛存在于胃癌中,对疾病的诊断和药物靶向治疗存在重要意义。蛋白质的磷酸化修饰是生命体内重要的修饰之一,几乎参与调节细胞的增殖、生长、分化、信号转导和肿瘤发生等生理、病理过程。利用蛋白质组学的概念和研究方法全面探索疾病细胞或组织中蛋白质磷酸化修饰变化,由此衍生出了磷酸化蛋白组学。许多研究利用磷酸化蛋白组学分析肿瘤组织中磷酸化调控机制,发现磷酸化参与调控许多与肿瘤发生发展相关的信号通路,比如免疫、代谢和DNA损伤修复等。经过生物信息学分析胃癌组织与癌旁组织蛋白质的磷酸化差异蛋白,发现这些磷酸化差异的蛋白主要参与RNA/DNA结合和mRNA剪切等DNA损伤修复相关通路。DNA损伤应答在肿瘤的发病机制研究和放射治疗耐受中起重要作用,DNA损伤修复被发现由许多蛋白磷酸化调节,而分子机制仍然需要进一步探索。对磷酸化差异蛋白的进一步挖掘,寻找到胃癌组织中磷酸化水平激活最明显的蛋白BCLAF1,该基因被报道参与DNA损伤修复,但是其磷酸化修饰的作用机制研究还未见报道。BCLAF1最初被发现是一种与BCL2家族成员有相互作用的蛋白质。随后的研究表明,BCLAF1在一些与BCL2家族成员的作用无关的过程中发挥关键作用,包括血管生成、T细胞活化和DNA损伤应答。近年来许多研究发现BCLAF1在肿瘤发生发展中发挥促进作用,能够通过调控HIF-1促进肝癌血管生成,诱导肺癌细胞发生顺铂化疗耐药,参与γ-H2AX介导的DNA损伤修复,提示BCLAF1具有癌基因作用。BCLAF1被发现具有多个磷酸化位点,但是哪一位点的磷酸化发挥了重要的促癌作用需要深入研究,我们的研究中发现BCLAF1（Ser290）位点在胃癌组织中显著激活,探索BCLAF1（Ser290）磷酸化的作用机制能够为癌症的诊断及预后提供新的分子靶点及理论依据。本课题期望通过胃癌蛋白质组学及氨基酸多样性的分析,详细阐述胃癌中蛋白质表达水平及磷酸化修饰情况,发现并挖掘胃癌相关的修饰蛋白,为胃癌的特异性诊断及精准治疗提供方法支持及理论基础。并且验证分析BCLAF1（Ser290）磷酸化在胃癌中的表达情况,进一步探讨其在胃癌放疗耐受的作用机制,为BCLAF1（Ser290）磷酸化作为一种新的分子靶标为胃癌诊断和临床应用提供一定的研究依据。第一部分胃癌蛋白质组学及氨基酸多样性的分析研究目的:通过对临床胃癌组织标本的蛋白质组学分析,探讨胃癌组织中蛋白质表达水平的变化,寻找新的有望成为胃癌诊断和治疗靶点的胃癌标志物。通过改进质谱数据的搜索方法对临床胃癌组织标本的蛋白质修饰组进行分析,探讨胃癌组织中蛋白质氨基酸的多样性,为发现胃癌特异性蛋白质修饰建立新的快速的方法。研究方法:选取经病理诊断确诊为胃癌的患者癌症组织及邻近癌旁组织,利用无标签蛋白质比较组学分析胃癌组织及癌旁组织的差异表达蛋白,并通过GO富集、KEGG通路分析以及STRING蛋白质相互作用等生物信息学方法分析胃癌相关的关键差异蛋白及分子标志物。通过非限制性搜索方法对胃癌相关的蛋白质氨基酸非零质量差进行数据分析,并通过高斯混合分布聚类和高斯回归迭代分析,总共得到579个高度可信的非零质量差聚类峰,能够精确地找到一些公认的已知修饰和氨基酸替代,以及未被定义的非零质量差。利用生物信息学对磷酸化修饰差异蛋白进行功能注释及通路分析。采用基因集富集分析（GSEA）鉴定了失调磷酸化蛋白与DNA损伤修复信号通路相关。通过绘制失调磷酸化蛋白的火山图,寻找胃癌中磷酸化修饰显著的蛋白。研究结果:1.蛋白质组学研究筛选到了 871种显著表达上调和251种表达下调的胃癌相关表达差异蛋白,上调蛋白中的关键蛋白CDH1、CASP3和MRPL4具有显著变化,且具有预后价值,可以作为潜在的药物干预靶点。2.本实验对胃癌蛋白质修饰组学的研究中共发现579种氨基酸可能发生的修饰类型,不仅鉴定出在肿瘤中发挥重要作用的磷酸化修饰,一些常见的修饰如乙酰化、甲基化和氧化等也在胃癌病人组织标本中被发现,同时分析出许多新的未知的修饰。3.确定了 2752种高度可信的氨基酸多样性,分布在32,306个蛋白质位点上。此外,还有些氨基酸多样性在胃癌组织和癌旁组织中呈差异性分布,暗示着这些氨基酸多样性与胃癌发生机制有关。4.经过对磷酸化修饰数据的进一步分析确定了 832个与胃癌相关的独特磷酸化位点,其中有25种在胃癌组织中显著上调的磷酸化位点,52个磷酸化位点下调。特别是BCLAF1蛋白290位点的丝氨酸（Ser）磷酸化在肿瘤中显著激活。5.富集分析发现失调磷酸化蛋白主要富集在DNA损伤反应相关途径。结论:通过蛋白质组、翻译后修饰组、磷酸化修饰组三个层面的系统分析,我们发现了胃癌异常表达的蛋白分子网络和翻译后修饰,胃癌组织中DNA损伤应答相关蛋白的磷酸化激活,其中BCLAF1蛋白Ser290位点的磷酸化在胃癌组织和胃癌细胞系中激活明显,BCLAF1（Ser290）磷酸化可能在胃癌DNA损伤修复中发挥作用。第二部分BCLAF1（Ser290）磷酸化增强胃癌细胞放疗耐受研究目的:以胃癌HGC-27和AGS细胞系为研究对象,在细胞水平探讨BCLAF1（Ser290）磷酸化参与调控胃癌细胞增殖与DNA损伤应答,阐明BCLAF1（Ser290）磷酸化通过参与DNA损伤修复调控胃癌细胞放疗耐受,为增加胃癌放疗的敏感性提供理论依据。通过胃癌组织芯片验证胃癌组织中BCLAF1（Ser290）磷酸化激活,并且对BCLAF1（Ser290）磷酸化情况与胃癌患者的生存期进行生存曲线分析,探讨BCLAF1（Ser290）磷酸化与临床病理参数的相关性及其临床意义。研究方法:将胃癌细胞系HGC-27中的总BCLAF1蛋白通过免疫沉淀获得后,进行质谱验证BCLAF1（Ser290）磷酸化位点的存在。设计与合成BCLAF1（Ser290）磷酸化的特异性抗体,利用Western Blot验证BCLAF1（Ser290）磷酸化水平在胃癌细胞系中较胃正常上皮细胞系明显激活。采用短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）在胃癌细胞系上降低BCLAF1蛋白的表达,构建敲低细胞系。构建BCLAF1过表达质粒,通过基因位点突变技术将Ser290位点分别突变为天冬氨酸模拟过磷酸化状态（S290D）、突变为丙氨酸模拟去磷酸化状态（S290A）,包装慢病毒（WT/S290D/S290A）后分别转染HGC-27/AGS细胞株使其稳定表达,为后续实验建立细胞模型。通过MTT细胞增殖、克隆形成和EdU细胞增殖实验分析细胞增殖水平。通过电离辐射诱导细胞DNA损伤,Western Blot和γ-H2AX细胞免疫荧光检测细胞DNA损伤修复情况,流式细胞术检测细胞的凋亡水平。应用胃癌组织芯片对180例胃癌组织及癌旁组织进行免疫组织化学染色检测BCLAF1（Ser290）磷酸化水平,并将其分为高水平组和低水平组,通过Kaplan-Meier方法分析BCLAF1（Ser290）磷酸化的高低与生存期的相关性。然后采用COX单因素与多因素风险模型分析BCLAF1（Ser290）磷酸化水平及临床病理因素与胃癌患者预后相关性。研究结果:1.将对数生长期的HGC-27细胞进行裂解,对获得的总蛋白以BCLAF1特异性抗体免疫沉淀,获得的沉淀产物进行SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色,切取BCLAF1位于的条带,进行胶内酶解后质谱鉴定。鉴定到在Ser290位点存在磷酸化,结果与胃癌组织磷酸化质谱分析结果一致,证实了我们高通量高分辨率质谱分析的有效性。2.利用BCLAF1（Ser290）的特异性磷酸化抗体对五种胃癌细胞系及胃正常上皮细胞中BCLAF1（Ser290）的磷酸化水平检测,发现在其胃癌细胞系中表达较高。3.BCLAF1敲低后细胞增殖受到抑制,并且BCLAF1（Ser290）模拟磷酸化细胞的增殖水平较WT组升高（P＜0.05）,BCLAF1（Ser290）去磷酸化细胞组的增殖水平较WT组降低（P＜0.05）。4.电离辐射引起胃癌细胞DNA损伤作用后BCLAF1表达升高,且BCLAF1敲低后细胞损伤增强。并且Western Blot和细胞免疫荧光结果表明电离辐射处理胃癌细胞后,BCLAF1（Ser290）磷酸化水平升高,且BCLAF1（Ser290）模拟磷酸化细胞的DNA损伤程度较WT组降低,BCLAF1（Ser290）去磷酸化细胞组的损伤程度较WT组升高（P＜0.05）。5.BCLAF1敲低后DNA损伤诱导的细胞凋亡水平增加。BCLAF1（Ser290）模拟磷酸化组细胞受DNA损伤诱导的凋亡水平较WT组降低,BCLAF1（Ser290）去磷酸化组细胞受DNA损伤诱导的凋亡水平较WT组升高（P＜0.05）。6.胃癌组织芯片结果证实了 BCLAF1（Ser290）磷酸化在胃癌组织中上调,且在细胞核表达。7.BCLAF1（Ser290）磷酸化与年龄相关（P=0.037）,与N分期相关（P=0.035）,具有统计学意义。8.Kaplan-Meier生存分析提示BCLAF1（Ser290）磷酸化高表达的胃癌患者显示了更差的总生存期（P=0.017）。9.单因素分析结果显示BCLAF1（Ser290）磷酸化水平、肿瘤的临床分期、T分期、N分期以及TNM分期均为患者总生存预后的影响因素。多因素COX风险模型分析提示肿瘤的临床分期、T分期及N分期为胃癌患者预后较差的独立危险因素（P＜0.05）。结论:BCLAF1（Ser290）磷酸化参与了 DNA损伤反应的调控,提示BCLAF1（Ser290）的磷酸化是影响放射治疗耐受性的重要靶点。胃癌组织中BCLAF1（Ser290）磷酸化激活,并且与胃癌患者的年龄及N分期密切相关。高水平BCLAF1（Ser290）磷酸化明显降低胃癌患者的总生存期,可作为胃癌预测预后的影响因素。BCLAF1（Ser290）磷酸化是一个在胃癌的发生、发展中起着重要的作用的潜在促癌因子,具有作为胃癌治疗靶标的潜在价值。