研究背景及目的 非病毒载体不能在基因治疗中被广泛应用的一个主要原因是目的基因的短暂表达。Chen等的研究发现即使质粒DNA没有丢失，也只能短暂表达转基因产物。最新的研究表明，外源基因表达盒与细菌质粒骨架之间的共价连接会导致外源基因的沉默，这是造成质粒载体所携带的外源基因在体内只能瞬时表达的主要原因，也是质粒载体临床应用的主要限制因素。 小环DNA(minicircleDNA)载体是一种自1997年发展起来的新型的基因载体，该载体所携带的外源基因的表达盒以环状超螺旋的形式存在。与常用的非病毒载体——质粒载体相比，小环DNA载体仅由外源基因的表达盒构成，不含有来自细菌质粒的骨架结构，从而减少了未甲基化的CpG所致的炎性反应，提高了安全性；而碱基数的减小，更有效的提高了目的基因的表达和生物利用度。小环DNA载体克服了质粒载体转染率低、易引起免疫反应及外源基因在体内表达时间短的缺点，是一种安全、高效的新型载体。 最初的小环载体需经体外酶切线性化细菌骨架、氯化铯密度梯度离心以获得纯化的小环DNA。小环纯化方法的复杂性增加了大规模制备的困难，限制了其在临床上的应用。Chen等在2003年构建的小环载体系统采用源于链霉菌温和噬菌体的φc31整合酶，并在母体质粒上插入内切酶I-SceI的表达盒。φc31整合酶在宿主菌内完成重组过程后，诱导I-SceI的表达，可将环状骨架及少量未重组的母体质粒消化成为线性DNA，继而在细菌核酸外切酶的作用下降解，小环DNA可以从细菌中一步获得，毋需进一步纯化，产率高，有利于大规模制备。 Folkman等提出肿瘤的生长是血管依赖性的，因此抑制肿瘤血管的生长是治疗肿瘤的一个有效策略。内皮细胞抑制素(endostatin，ES)，是1997年0’Reilly和Folkman在患血管内皮瘤的小鼠血清中分离得到的一种血管生成抑制因子，分子量为20kDa，由胶原蛋白ⅩⅧ的C-末端胶原区内的184个氨基酸片段构成，能特异性抑制血管内皮细胞的生长，而不影响其它非内皮系统起源的细胞。在内源性血管生成抑制剂中，内皮抑素有最广泛的抗肿瘤谱，它所靶向的血管生成调节基因占基因组的12％。内皮细胞抑制素通过上调与血管生成抑制相关的基因，下调与血管生成促进相关的基因而对血管生成的多条信号通路进行调节。 目前有关小环DNA的研究仅限于构建和纯化方法的研究，尚无携带内皮抑素治疗肿瘤的报道。本实验旨在采用含有φc31整合酶的质粒pφC31，构建表达人内皮抑素的小环DNA载体，并与普通质粒在体外培养真核细胞和动物模型中的表达效率和表达时间进行比较；并观察其对裸鼠鼻咽癌移植瘤的抑制作用。 方法从pcDNA3.1(+)中分别扩增Pcmv和BGHpolyA片段，定向克隆于pSP72中，构建成pSP72-Pcmv-BGHpolyA。将从pSP72-hEndostatin-IRES-EGFP中酶切得到的hEndostatin-IRES-EGFP克隆到pSP72-Pcmv-BGHpolyA，构建成pSP72-Pcmv-hEndostatin-IRES-EGFP-BGHpolyA(pSP72-hES)。将pSP72-hES中的整个表达框亚克隆至pφC31构建母环质粒pφ-hES。pφ-hES在含阿拉伯糖的LB培养液中，32℃诱导φC31整合酶介导的分子内重组，产生一个只含目的基因表达盒的小环和一个含有细菌骨架的小质粒。继而在37℃激活I-SceI酶降解闭环的细菌骨架后，抽提获取小环mc-hES。 将hEndostatin-IRES-EGFP片段亚克隆至pcDNA3.1载体构建endostatin的普通真核表达质粒pcDNA-hES作为研究的对照。 将mc-hES、pφ-hES、pcDNA-hES分别转染CNE2细胞48小时后，通过RT-PCR和Westernblot观察其表达。MTT法检测endostatin对HUVEC的增殖抑制作用。建立CNE2裸鼠移植瘤模型，观察mc-hES和pcDNA-hES的抑瘤活性。通过RT-PCR检测mc-hES介导转基因在体内的长期表达。免疫组化检测内皮抑素在肿瘤组织中的表达。 结果经DNA测序表明构建的pφ-hES、mc-hES、pcDNA-hES序列正确，转染CNE2细胞后，均有EGFP和人内皮抑素蛋白的表达。在相同情况下，小环DNA载体的转染效率和目的基因表达强度均优于传统的质粒载体。MTT显示endostatin抑制HUVEC的增殖，而对CNE2无作用。体内实验显示：小环组肿瘤体积明显小于空质粒对照组和pcDNA-hES组。mc-hES组较pcDNA-hES组能明显抑制肿瘤的生长(P＜0.05)。RT-PCR结果显示小环组在体内可以表达内皮抑素蛋白20天以上，而pcDNA-hES对照组则在第7天时就已经很弱，在第14天时就检测不到内皮抑素的表达。mc-hES、pcDNA-hES、空质粒组抑瘤率分别为46.42％、15.8％、1.8％，小环组较pcDNA-hES组有显著性差异，生理盐水组和空载体组无显著性差异。 结论1成功构建了真核表达载体pφ-hES、mc-hES、pcDNA-hES，转染真核细胞后在mRNA和蛋白水平证实有hEndostatin和EGFP的表达，且在相同情况下，小环组明显高于其他两组。 2内皮抑素能特异抑制血管内皮细胞的增殖，而对鼻咽癌细胞无抑制作用。内皮抑素对肿瘤的抑制作用是通过抑制肿瘤血管的形成而起作用的。 3mc-hES在一次给药后，较pcDNA-hES能明显抑制裸鼠鼻咽癌移植瘤的生长，长期高效表达内皮抑素蛋白，达20天之久，明显长于普通质粒。 4小环较普通质粒更能长期、高效的介导转基因的表达，是一种较为理想的基因治疗的载体，同时为小环载体的临床应用提供了重要的实验依据。