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分娩是由多因素作用、多途径调节、多分子参与、多阶段变化的交互作用过程。子宫平滑肌的收缩是分娩发动的关键环节。若能探明分娩发动机制对病理妊娠计划分娩、减少早产及高危儿的出生,具有重要的临床意义。在前期的研究中,我课题组已应用基因芯片技术得到了人类自然临产与未临产子宫体部与子宫下段的差异基因表达谱,发现Calponin-1等在临产后的子宫体部及下段均呈高表达,可能与调控子宫平滑肌细胞功能密切相关。Calponin-1蛋白结构已经研究清楚,但对它在平滑肌收缩功能的调节机制研究大多集中在血管平滑肌上,对其参与子宫平滑肌收缩的调节机制研究较少。本研究拟在前期工作基础上进一步探讨Calponin-1基因表达上调在分娩发动中调控子宫平滑肌细胞的分子机制。目的：探讨Calponin-1在临产前后子宫平滑肌组织中的表达及意义。方法：选取14例初产妇的子宫体部和子宫下段平滑肌组织,分为未临产组(NIL)和临产组(IL),采用免疫组织化学(Immunohistochemistry)和免疫印迹(Western-blot)方法检测Calponin-1蛋白(Calponin-1)和磷酸化Calponin-1蛋白(pCalponin-1)的表达。结果：1.免疫组织化学14例子宫平滑肌组织中均可见Calponin-1及pCalponin-1蛋白阳性表达,阳性表达定位在平滑肌细胞胞浆,呈棕黄色。(1)在未临产组(NIL)与临产组(IL)子宫体平滑肌组织中Calponin-1蛋白阳性表达的平均灰度值分别为：184.91±5.12和167.32±5.22,两组比较差异具有显著性(p＜0.05);在未临产组(NIL)与临产组(IL)子宫下段平滑肌组织中Calponin-1蛋白阳性表达的平均灰度值分别为：174.51±4.82和165.42±4.52,两组比较差异具有显著性(p＜0.05)。(2)在未临产组(NIL)与临产组(IL)子宫体平滑肌组织中pCalponin-1蛋白阳性表达的平均灰度值分为：148.22±11.95和90.42±12.22,两组比较差异具有显著性(p＜0.05)；在未临产组(NIL)与临产组(IL)子宫下段平滑肌组织中pCalponin-1蛋白阳性表达的平均灰度值分别为：151.34±10.36和113.42±10.22,两组比较差异具有显著性(p＜0.05)。2.免疫印迹(1)在未临产组(NIL)与临产组(IL)子宫体平滑肌组织中Calponin-1蛋白的相对表达量分别为：0.373±0.092和0.865±0.090,两组比较差异具有显著性(p＜0.05)；在未临产组(NIL)与临产组(IL)子宫下段平滑肌组织中Calponin-1蛋白的相对表达量分别为：0.522±0.102和0.957±0.081,两组比较差异具有显著性(p＜0.05)。(2) pCalponin-1蛋白表达水平检测结果显示：未临产组(NIL)和临产(IL)组子宫体平滑肌组织中pCalponin-1蛋白的相对表达量分别为：0.303±0.071和0.532±0.063,两组比较差异具有显著性(p＜0.05),未临产组(NIL)和临产(IL)组子宫下段平滑肌组织中pCalponin-1蛋白的相对表达量分别为：0.274±0.091和0.567±0.085,两组比较差异具有显著性(p＜0.05)。结论：临产后子宫平滑肌组织中Calponin-1及pCalponin-1蛋白的表达上调与临产后子宫平滑肌的收缩状态有关,提示临产后子宫平滑肌的收缩可能部分依赖于Calponin-1及pCalponin-1的表达。目的：探讨Calponin-1蛋白表达抑制对妊娠子宫平滑肌细胞功能的影响,研究其在分娩发动中的分子作用机制。方法：采用消化酶法对人子宫平滑肌组织进行子宫平滑肌细胞原代培养,并用免疫细胞化学方法进行鉴定。构建腺病毒siRNA-Calponin-1质粒转染子宫平滑肌细胞沉默Calponin-1表达,采用MTT、流式细胞术、Transwell小室的变化、免疫荧光标记和荧光显微镜观察平滑肌细胞骨架蛋白F-actin表达的变化等方法研究Calponin-1调控子宫平滑肌细胞的作用,实验分三组：实验组、空白对照组、空载体组。结果：1.原代子宫平滑肌细胞的培养及鉴定培养的子宫平滑肌细胞呈典型的梭状肌细胞样生长,用平滑肌肌动蛋白抗体,经免疫细胞化学染色显示原代培养的子宫平滑肌细胞胞质呈棕色,证明获得的原代子宫平滑肌细胞符合后续实验的要求。2. siRNA-Calponin-1腺病毒有效抑制Calponin-1 mRNA和蛋白的表达采用RT-PCR和Western-blot方法检测pAd-mU6pro-Calponin-l-siRNA转染后子宫平滑肌细胞中Calponin-1 mRNA和蛋白的表达,结果显示：实验组、阴性对照组、空白对照组Calponin-1mRNA的相对表达量分别为0.0463±0.0045、0.2513±0.0552、0.3124±0.0037；实验组、阴性对照组、空白对照组Calponin-1蛋白的相对表达量分别为0.1098±0.0127、0.2758±0.0384、0.3187±0.0425。实验组与阴性对照组、空白对照组比较,差异有统计学意义(p＜0.05),阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义(p＞0.05)。3.体外实验中抑制Calponin-1的表达可以抑制子宫平滑肌细胞的迁移运动而不影响其增殖和凋亡Transwell侵袭小室测定法结果显示24小时培养后实验组、空载体组,空白对照组穿过Transwell的每低倍视野细胞数分别为64±12、122±14、125±10,实验组与空载体组、空白对照组比较,差异有统计学意义(p<0.05)；空载体组与空白对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。MTT法检测转染24h、48h、72h后细胞的存活率,结果显示三组细胞存活率两两比较差异无统计学意义(p>0.05)。流式细胞仪检测结果显示,三组细胞凋亡率分别为4.22%、3.02%、4.64%,两两比较差异无统计学意义(p>0.05)。4.体外实验中抑制Calponin-1的表达可以引起子宫平滑肌细胞骨架蛋白F-actin的改变实验组子宫平滑肌细胞中F-actin排列紊乱、稀疏。空载体组与空白对照组子宫平滑肌细胞中F-actin微丝明显粗长,大多沿细胞纵轴呈平行排列。实验组、空载体组、空白对照组子宫平滑肌细胞中的F-actin荧光强度分别为832.22±99.02、1123.32±102.35、1089.19±110.53,实验组与空载体组、空白对照组比较差异具有显著性(p<0.01)；而空载体组与空白对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。结论：1.构建的Calponin-1siRNA干扰质粒能有效沉默Calponin-1基因表达。2.体外实验中抑制Calponin-1的表达可以抑制子宫平滑肌细胞的迁移运动而不影响其增殖和凋亡。3. Calponin-1通过影响子宫平滑肌细胞中骨架蛋白F-actin的改变调节子宫平滑肌的收缩。目的：探讨硫酸镁及缩宫素调节子宫平滑肌细胞收缩与Calponin-1表达水平的相关性。方法：用硫酸镁及缩宫素作用于体外培养的子宫平滑肌细胞,然后采用Western-blot及RT-PCR的方法对子宫平滑肌组织中Calponin-1的表达进行检测。结果：1.体外硫酸镁对子宫平滑肌细胞Calponin-1表达的影响(1) RT-PCR结果硫酸镁作用子宫平滑肌细胞30分钟后,阴性对照组、2.0%、4.0%、8.0%、16%浓度硫酸镁组Calponin-lmRNA的相对表达量分别为：0.2476±0.0431、0.2562±0.0382、0.2813±0.0243、0.3011±0.0135、0.3042±0.0119,组间比较差异无统计学意义(p>0.05)。(2) Western Blot结果硫酸镁作用子宫平滑肌细胞24h后,阴性对照组、2.0%、4.0%、8.0%、16%浓度硫酸镁组Calponin-1蛋白的相对表达量分别为：0.2135±0.0537、0.2572±0.0378、0.2813±0.0351、0.3147±0.0161、0.3185±0.0134,组间比较差异无统计学意义(p>0.05)。2.体外缩宫素对子宫平滑肌细胞Calponin-1表达的影响(1)RT-PCR结果缩宫素作用子宫平滑肌细胞30分钟后,阴性对照组、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%浓度缩宫素组Calponin-1mRNA的相对表达量分别为：0.1936±0.0283、0.4382±0.0355、0.6232±0.0491、0.3951±0.0762、0.3976±0.0647,各浓度组与阴性对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05),其中以4.0%浓度组Calponin-1mRNA表达最为显著。(2) Western Blot结果缩宫素作用子宫平滑肌细胞24h后,阴性对照组、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%浓度缩宫素组Calponin-1蛋白的相对表达量分别为：0.2095±0.0153、0.4831±0.0368、0.6197±0.0425、0.4105±0.0148、0.4112±0.0135,各浓度组与阴性对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05),其中以4.0%浓度组的Calponin-1蛋白上调最为显著。我们用4.0%浓度组缩宫素作用子宫平滑肌细胞,在0h、24h、48h、96h不同时间段,用Western Blot检测Calponin-1蛋白表达水平。结果显示,0h、24h、48h、96h时间段Calponin-1蛋白的相对表达量分别为：0.2014±0.0115、0.5097±0.0127、0.3865±0.0454、0.2247±0.0216,结果提示,缩宫素上调Calponin-1蛋白表达与其作用时间具有相关性,以作用24h时Calponin-1蛋白表达上调最为明显。结论：1.体外缩宫素可以上调子宫平滑肌细胞Calponin-1的表达,且与其浓度及作用时间具有相关性,但与缩宫素作用浓度及作用时间并无明显正／或负相关。2.缩宫素通过上调子宫平滑肌细胞Calponin-1的表达而引发宫·缩,导致分娩发动,这可能是缩宫素促进子宫平滑肌细胞收缩的又一新的作用途经。3.体外硫酸镁不影响子宫平滑肌细胞Calponin-1的表达,我们推测Calponin-1调控子宫平滑肌收缩的作用可能并不依赖于Ca2+通道。