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壳聚糖(Chitosan CS)是一种天然的多聚糖,带一定的量的胺基,溶于酸性介质,并带一定正电荷。它来源广泛,价格低廉,具有良好的生物学性能,不会引起过敏反应和排斥反应,在体内能逐步降解,具有良好的生物相容性和生物可降解性。壳聚糖具有抗菌活性、生物黏附作用、絮凝作用和抗癌活性;能够加工成不同形式,如粉末,膜剂,糊剂,纤维等。正是由于这些性质使壳聚糖在生物医学和药物制剂学方面的应用引起越来越多的注意。 在本课题中,我们主要研究了壳聚糖作为基因药物载体和细胞生长支架方面的应用。我们制备了CS与反义寡核苷酸(antisense onligodeoxynucleotides,ODN)的复合物(ODN/CS),对ODN/CS进行了粒度分析和琼脂凝胶电泳试验。体外培养了COS7细胞,进行了ODN/CS摄取实验,并进一步对影响细胞摄取的因素如:N/P、培养基的pH值以及血清浓度进行了分析。同时在壳聚糖上偶联了四甲基异硫氰酸罗丹明,与嫁接了FITC的ODN形成复合物,利用荧光显色,考察了二者在细胞内的分布。实验结果表明CS与ODN通过静电作用能够形成复合物,粒径约200nm以下。在琼脂凝胶阻滞实验中,当N/P为3时,能够完全阻滞。一般来讲,细胞膜带一定负电荷,而ODN/CS带一定的正电荷,因此ODN/CS能通过静电作用吸附到细胞表面,进而通过内吞作用被细胞摄取。随着N/P比的增大,细胞的阳性率也增加。在培养基的pH为6.9时,摄取率最高。血清中存在很多成分,其中的血清蛋白带负电能与壳聚糖相互吸附,低浓度血清(10%、20%)对细胞的摄取没有多大影响,而高浓度血清(30%)则明显降低了细胞的摄取率。通过荧光显微镜发现CS与ODN一起存在于细胞中,并能够从溶酶体中逃逸到胞浆中。 在非病毒载体研究中阳离子脂质体的转染效率比较高,但是阳离子脂类的毒性比较大。阴离子脂质体毒性很小,但由于其较低的包封率不适合作为基因药物的载体。阳离子聚合物中的壳聚糖几乎没有毒性,但是传递基因药物的能力比较弱。本研究结合了阳离子聚合物技术和脂质体技术,根据二者各自的特点,将带有一定负电荷的脂质体与CS和核酸药物形成的复合物混合,使二者通过静电作用相互吸附,形成脂质体—核酸/CS复合物(L-DN/CS)。采用了透射电镜、粒度分析、zeta电位测定对L-DN/CS进行了物理表征,体外培养了hela细胞,MTT实验和