目的:应用酵母双杂交法检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)与hDaxx的相互作用,并初步探讨其相互作用后对细胞凋亡的影响,为进一步研究HBx在HBV慢性感染致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法:(1)构建酵母菌真核表达载体pGADT7-HBx:根据已知的HBV X基因序列,采用Primer Premier5.0软件设计一对引物,并分别引入EcoR I与Xho I酶切位点,PCR扩增X基因;用EcoRI和Xho I分别双酶切PCR产物和质粒pGADT7,分别纯化回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。对重组质粒进行酶切及测序鉴定。(2)构建酵母菌真核表达载体pGBKT7-hDaxx:用EcoRI和SalI分别双酶切质粒pGBDU-C1/hDaxx和pGBKT7,分别纯化回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,筛选到阳性克隆后,对重组质粒行酶切鉴定。(3)酵母双杂交检测HBx与hDaxx的相互作用:将酵母菌真核表达载体及酵母菌阴性阳性对照质粒分4组转化酵母菌AH109,A组为pGADT7和pGBKT7、B组为pGADT7-HBx和pGBKT7-hDaxx、C组为pGADT7-T和pGBKT7-Lam、D组为pGADT7-T和pGBKT7-p53,将转化菌落接种于SD/-Trp-Leu(二缺)固体平板,30℃培养2～4d。将单个菌落接种于SD/-Trp-Leu-His(三缺)和SD/-Trp-Leu-His-Ade(四缺)平板,30℃培养2～4d。裂解酵母菌,提取蛋白,经SDS-PAGE、Western blot检测hDaxx和HBx在酵母中的表达。(4)流式细胞术检测细胞凋亡:将HBV X基因稳定转染入HepG2细胞(即HepG2X),再瞬时转染15μg、30μg和45μg pcDAN3.1-hDaxx,以pcDNA3.1(+)转染HepG2X组和HepG2X组分别作为对照。用10mmol/L的5-氟尿嘧啶(5-FU)处理36h后分别收集各组细胞,经75%的乙醇4℃固定过夜,PI染色后,用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。用统计软件SPSS13.0对实验数据进行LSD-t检验分析。结果:(1) PCR扩增HBV X基因片段(465bp),将X基因克隆至pGADT7载体上,经双酶切及测序分析,所克隆的目的片段与已知的X基因序列及GeneBank上公布的HBV X基因(Pubmed NC_U95551)序列完全一致。(2)将pGBDU-C1/hDaxx上的hDaxx基因片段亚克隆至pGBKT7载体上,经双酶切分析,得约2.2kb大小的hDaxx基因片段,与预期值大小一致。(3)分4组转化的酵母菌AH109在二缺陷平板上均可长出白色菌落,但仅有B、D两组菌可以在三缺和四缺平板上生长,选取B组四缺陷平板上单个菌落,提取酵母蛋白, Western blot检测到hDaxx和HBx在同一株酵母菌株中均有表达。(4)将X基因稳定转染入HepG2细胞,Western blot检测到HBx在HepG2X细胞中的表达。经流式细胞术检测,HepG2细胞用5-FU处理后凋亡率明显高于未经5-FU处理的细胞组,结果具有显著性差异(P<0.01);HepG2X组细胞凋亡率明显低于空细胞组,结果具有显著性差异(P<0.01);而转染pcDAN3.1-hDaxx后,细胞凋亡率进一步降低,但与转染入的pcDAN3.1-hDaxx量没有剂量依赖关系。结论:(1)成功地构建了pGBKT7-hDaxx和pGADT7-HBx酵母菌真核表达载体,并可在酵母菌AH109中表达。(2) HBx与hDaxx在酵母细胞内存在相互作用。(3)构建了稳定表达HBx的细胞株HepG2X。(4) HBx可抑制5-FU诱导的HepG2细胞凋亡,而hDaxx的高表达能提高HBx的抑制作用,使细胞凋亡率进一步降低。