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棉花(Gossypium spp.)是一种重要的经济作物,棉纤维是纺织工业重要的原材料。棉纤维发育是一个高度程序化的调控过程,提高棉纤维的产量和品质是棉花育种研究的一个主要目标,因此,研究棉纤维发育及其相关基因的功能具有重要的意义。
GhRDL7(G.hirsutum RD22-1ike1)是一个在棉纤维伸长期特异高表达的基因,编码一个含有信号肽的335个氨基酸残基的蛋白,与拟南芥的AtRD22蛋白同源性达53%。GhRDL1和AtRD22蛋白C端都含一个植物特有的BURP结构域,目前对其功能研究较少。YFP融合蛋白的亚细胞定位结果表明,GhRDL1和AtRD22全长蛋白都定位在细胞壁。进一步研究表明GhRDL1的C端(125-335 aa,BURP结构域)定位信号与细胞壁染料碘化丙啶的染色结果重合;而其N端(1-124 aa)则定位在胞内,可见BURP结构域的定位决定了BURP蛋白GhRDL1的亚细胞定位。利用酵母双杂交的方法,筛选到GhEXPA1(G.hirsutum a-expansinl)蛋白可与GhRDL1蛋白相互作用。与GhRDL1相似,Gh EXPA1也在棉纤维快速伸长期高表达。已有的研究显示α-expansin主要通过疏松细胞壁来促进植物细胞的生长。进一步的酵母双杂交实验证明GhEXPA1可以与GhRDL1全长蛋白结合,而不能与GhRDL1的N端或者C端结构域相互作用。另外,通过在拟南芥中的半分子荧光互补实验(BiFC)也验证了GhEXPA1与GhRDL1的相互作用。
为了研究GhRDL1功能,利用农杆菌介导的方法将35S::GFP-GhRDL1转化棉花R15株系(G. hirsutum cv. R15),获得至少10个不同T-DNA插入的转基因株系,发现转基因棉花的纤维长度和种子大小较对照明显增加。利用萌发后6天棉花幼苗分析了转基因后代下胚轴的力学特征变化,结果表明拉断转基因植物下胚轴所需的平均作用力显著大于对照。对田间种植的T3代纯合转基因株系R-105,R-117和R-119的分析表明,与对照相比,GFP-GhRDL7转基因棉花的纤维长度增加了7-15%;种子百粒重(籽指)增加13-17%。另外,纤维整齐度指数和断裂比强度均有不同程度的增加。显微观察显示转基因棉花种子的内种皮细胞显著大于对照。这些结果表明在棉花中过量表达GFP-GhRDL1融合蛋白可促进棉花纤维和胚珠的发育,增加纤维长度和种子大小,对于棉花改良具有重要价值。
拟南芥的转基因结果表明,过量表达GhRDL1或者GhEXPA1均导致种子变大,而同时表达GhRDL1和GhEXPAl(RE)能促进植物生长和产量增加。具体表现为:转基因拟南芥抽苔的快速增高,40-DAG地上部分生物量增加;果荚数目增加和单株收获干种子生物量(产量)的增加,其中产量相对于野生型增加了一倍左右,而单表达GhRDL1或GhEXPA1的转基因植物增加了50%左右。另外,一个有趣的现象是拟南芥RD22、棉花GhRDL1和GhEXPA1可影响ABA诱导拟南芥气孔关闭的过程:rd22突变体气孔的关闭表现为对ABA的不敏感,而Pr035S::RD22和Pr035S::GhRDL1植物表现为一定程度的超敏感;GhEXPA1的表达有增强GhRDL1对气孔关闭的影响程度。进一步实验中,共同过量表达GhRDL1和GhEXPA1的转基因棉花结铃数较野生型显著增多,这和转基因拟南芥具有更多果荚的表型是一致的。同时RE棉花的纤维长度并不比野生型短,尽管和GhRDL1转基因棉花相比,三个RE棉花株系中的两个的纤维较前者短。该结果显示了RE转基因棉花与野生型相比在纤维产量上有显著的增加。
棉纤维BURP蛋白GhRDL1可能通过与a-expansin蛋白GhEXPA1在细胞壁的相互作用。在拟南芥中单表达这两个基因均能促进种子变大,而两者的共表达导致茎伸长加快、结实数增多和种子量的大幅增加。在转基因棉花方面,单表达GhRDL1能促进纤维伸长和种子变大,而共同过量表达GhRDL1和GhEXPA1能产出显著多的棉铃,进一步促进纤维产量的增加。本论文的研究结果有助于进一步认识棉纤维的发育机制以及细胞壁蛋白在细胞生长过程中的重要作用,对于提高大豆和油菜等农作物的产量具有积极作用。