表达ido的重组谷氨酸棒杆菌代谢途径改造以提高4-羟基异亮氨酸的产量

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4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)具有促进胰岛素分泌、降低胰岛素抵抗的生物活性,因此在治疗糖尿病方面有良好应用前景。实验室前期在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)L-异亮氨酸生产菌株C.glutamicum ssp.lactofermentum SN01(以下简称Cgl)中克隆表达异亮氨酸双加氧酶基因ido,成功将该菌株内源合成的L-异亮氨酸(L-isoleucine,Ile)转化为4-HIL。本研究为了进一步提高4-HIL产量,对该菌株的代谢途径进行了改造。主要研究内容及结果如下:(1)为了加强Ile的供应,过表达Ile合成途径第一个酶的编码基因lysC(编码天冬氨酸激酶)并构建菌株Cgl/p4-ido-lysC。摇瓶发酵120 h后Cgl/p4-ido-lysC的4-HIL产量仅为24.00±4.32 mmol·L-1,Ile向4-HIL的转化率仅为32%,两者都明显低于对照菌Cgl/p4-ido(分别为56.24±0.35 mmol·L-1,92%)。但是其天冬氨酸族氨基酸总量达到134.32±6.72 mmol·L-1,相对于Cgl/p4-ido提高了56%。说明过表达lysC促进了天冬氨酸族氨基酸的合成但不利于4-HIL的合成。(2)为了加强草酰乙酸的回补,过表达ppc(编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)并构建菌株Cgl/p4-ido-ppc。摇瓶发酵144 h后其4-HIL产量达到95.72±1.52 mmol·L-1,相对于Cgl/p4-ido菌株提高了29%,Ile向4-HIL的转化率达到90%。说明过表达ppc有助于提高重组菌的4-HIL产量。(3)构建了ppc、lysC共表达菌株Cgl/p4-ido-lysC-ppc。摇瓶发酵144 h后,该菌株4-HIL产量仅为30.16±2.01 mmol·L-1,Ile向4-HIL的转化率仅为31%,但天冬氨酸族氨基酸总量达到181.15±3.35 mmol·L-1,相对于Cgl/p4-ido-ppc菌株提高了27%。(4)为了加强α-酮戊二酸的供应,构建了pknG(编码一种蛋白激酶)敲除菌株CglΔpknG/p4,该菌株的Ile合成能力相对于Cgl/p4明显降低。为了研究pknG敲除对4-HIL发酵的影响,构建了CglΔpknG/p4-ido,CglΔpknG/p4-ido-ppc和CglΔpknG/p4-ido-lysCppc菌株。摇瓶发酵144 h后它们的4-HIL产量分别为57.35±1.68 mmol·L-1、86.95±4.15mmol·L-1和59.71±3.27 mmol·L-1。其中CglΔpknG/p4-ido-ppc相对于CglΔpknG/p4-ido 4-HIL产量提高了51%,再次证明过表达ppc有助于提高4-HIL产量。CglΔpknG/p4-idolysC-ppc菌株的4-HIL产量和Ile向4-HIL的转化率分别为59.71±3.27 mmol·L-1和76%,相对于Cgl/p4-ido-lysC-ppc菌株都有明显提高。具体原因需要进一步研究。因此,过表达ppc促进了4-HIL的合成,而过表达lysC促进了天冬氨酸族氨基酸的合成但不利于Ile向4-HIL转化,敲除pknG提高了lysC-ppc共表达菌中4-HIL产量。
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