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丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)感染引起的丙型病毒性肝炎及诱发的肝硬化、肝癌等疾病已严重威胁到人类健康,缺乏相应的疫苗和抗病毒药物的局限性是控制HCV感染和治疗相关疾病的主要障碍。HCV主要依赖于宿主因子完成病毒的入侵、复制、组装和释放,因此找出与HCV相互作用的宿主因子有助于阐明HCV的感染过程和宿主应答的分子机制,同时对发现新的抗病毒治疗的药物靶标和研制有效的HCV疫苗有着重要的理论和实际意义。HCV感染能诱导宿主细胞发生自噬,HCV复制的起始依赖于自噬相关蛋白,而且HCV诱导的自噬通过抑制宿主细胞天然免疫应答进而促进HCV的复制。但是HCV利用自噬进行自身复制的具体分子机制目前仍不清楚。本课题组在筛选与HCV诱导自噬相关的宿主因子时,发现荷电多囊体蛋白4B(charged multivesicular body protein 4B, CHMP4B)表达升高。CHMP4B作为转运必需内涵体分选复合物-Ⅲ(endosomal sorting complex required for transport-Ⅲ, ESCRT-Ⅲ)的重要组成部分,参与细胞分裂,调节自噬,同时还参与HCV病毒颗粒的释放。但是,CHMP4B调节自噬和影响HCV病毒颗粒释放的具体分子机制不明。因此,本研究拟解决的第一个问题是：CHMP4B在HCV感染中发挥的作用是什么?本研究利用慢病毒介导的shRNA敲低CHMP4B,通过Western Blot和Real-time PCR检测发现,瞬时敲低CHMP4B导致宿主细胞内HCV蛋白水平下降而HCV RNA水平不变。为进一步研究CHMP4B通过与哪些宿主蛋白相互作用从而影响HCV蛋白表达,我们拟利用串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)技术筛选HCV感染时与CHMP4B相互作用的宿主蛋白。为此,我们利用慢病毒介导的shRNA构建了CHMP4B稳定敲低的Huh7.5细胞系,拟通过外源表达与内源表达水平相当的带纯化标签的CHMP4B进行串联亲和纯化以获得与CHMP4B相互作用蛋白。然而,我们通过Western Blot和Real-time PCR发现,稳定转导CHMP4B shRNA和无靶标对照shRNA时Huh7.5细胞胞内HCV蛋白和RNA水平均明显下降,而瞬时转导无靶标对照shRNA胞内HCV蛋白和RNA水平无明显变化,提示shRNA稳定转导可能诱导产生脱靶效应抑制HCV的增殖。因此,本研究针对shRNA稳定转导诱导的这种非特异性脱靶效应的机制进行了深入研究。为了验证脱靶效应是不是由于激活天然免疫应答所致,首先,我们通过双荧光素酶报告系统检测HCV感染后shRNA稳定转导细胞中IFN-β启动子的活性,发现IFN-β启动子活性无明显变化,提示脱靶效应并非通过激活I型干扰素通路诱导产生；其次,我们通过Real-time PCR方法检测shRNA稳定转导细胞上清处理Huh7.5细胞后胞内HCVRNA的变化,发现胞内HCV RNA的含量无明显变化,提示脱靶效应也不依赖于抗病毒因子的产生。瞬时转导时shRNA高水平表达会通过干扰宿主miRNA从而抑制HCV复制,提示shRNA的稳定转导可能也干扰miRNA的表达从而抑制HCV复制,因此本研究用miRNA芯片检测了shRNA稳定转导细胞的miRNA表达谱。结果发现宿主细胞的miRNA表达谱发生显著变化,提示脱靶效应的产生可能与miRNA表达谱的变化相关。对miRNA表达谱进一步分析表明,低水平的shRNA稳定表达即可影响宿主miRNA的表达,进而影响HCV增殖。另外,shRNA整合位点也可能影响miRNA表达谱的变化,进而影响HCV的增殖。miRNA表达谱中有60个miRNA表达水平有两倍以上的变化,其中三个miRNA文献已报道参与HCV感染的调控：miR-196a、miR-491和miR-149。为进一步验证是不是miRNA表达谱的变化影响了HCV的增殖,除上述3个miRNA卜,本研究还挑选了变化倍数较大且与上述miRNA变化趋势一致的4个miRNA:miR-1246、miR-193、miR-744和miR-769,通过Real-time PCR检测转染相应miRNA mimic和inhibitor后HCV增殖的情况。结果发现,过表达miR-196a或敲低miR-491均抑制HCV的增殖,与文献报道一致,miR-149对HCV增殖无影响,也与文献报道其参与调控HCV入侵一致；过表达miR一1246抑制HCV增殖,而miR-744、miR-193和miR-769对HCV增殖无影响。上述结果提示,慢病毒介导的shRNA通过干扰miRNA表达谱非特异性抑制HCV的增殖。另外,我们新发现miR-1246参与调控HCV增殖,其具体分子机制仍待进-步研究。综上所述,我们的研究一方面提高了对慢病毒shRNA稳定转导产生非特异性脱靶效应的认识,另一方面本研究鉴定出的受shRNA调节的miRNA可能会为HCV感染提供新的治疗策略。