研究背景卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤,发病隐匿,发现时多为中晚期,预后较差。化疗是卵巢癌重要的治疗手段,但绝大多数化疗药物缺乏细胞选择性,难以特异性聚集于肿瘤组织局部且具有不良反应,严重影响了患者生活质量并降低了治疗依从性。目前开发高选择性且无毒的药物载体提高化疗药物的靶向性,尽量提高药效降低毒副反应、甚至逆转耐药是当前卵巢癌治疗研究的重要方向。DNA纳米技术是一种构建纳米药物载体的理想技术。DNA分子具有生物相容性,结构可编程特性,通过合理的序列设计,能够方便的精确构建出多种形状和尺度的DNA纳米药物载体。利用DNA纳米技术构建可控纳米药物载体,荷载化疗药物进行卵巢癌治疗的体内外实验具有重大科研究价值。研究目的1、构建粒径可控的纳米药物载体。利用DNA纳米技术制备DNA自组装纳米折纸(DNA Origami)并进行多柔吡星荷载试验,检测其载药性能,药物释放条件。2、开展纳米载药体系的卵巢癌细胞体外实验研究。通过体外细胞实验研究荷载多柔吡星的DNA折纸对人卵巢癌细胞的作用效果,并针对游离多柔吡星及不同粒径DNA折纸药物复合体开展比较研究。3、开展纳米载药体系的卵巢癌体内实验研究。建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,进行荷载多柔吡星的DNA折纸活体动物实验,评估治疗效果。研究方法1.利用DNA纳米技术制备DNA纳米折纸(DNA Origami)。构建两种粒径DNA折纸作为多柔吡星的纳米药物载体,通过热力学仿真计算分析不同粒径折纸的热力学稳定性,并通过凝胶电泳,原子力显微镜(AFM)检测其粒径、表面形态、稳定性。2.通过吸收光谱研究DNA折纸荷载多柔吡星(Dox)的载药能力。通过阶梯浓度的多柔吡星溶液在480nnm处吸收峰值标定多柔毗星摩尔消光系数；通过超滤离心分离游离多柔吡星,测量不同粒径DNA折纸荷载多柔吡星的载药效率；对比分析不同pH值、不同时间条件下两种粒径DNA折纸作为多柔吡星药物载体的药物释放曲线。3.研究载多柔吡星DNA折纸(Dox-Origami Complex)对人卵巢癌细胞A2780的体外治疗效果。采用CCK-8细胞增殖实验研究DNA折纸的细胞相容性；采用CCK-8细胞生长曲线测定,克隆形成实验比较不同粒径折纸为载体的Dox-Origami Complex及游离Dox对人卵巢癌细胞A2780的作用。通过免疫荧光实验、共聚焦显微镜观察,比较Dox 及 Dox-Origami Complex在A2780细胞的胞内定位及荧光强度。通过流式细胞仪定量测量相同条件下A2780细胞对Dox及Dox-Origami Complex的摄取；加入不同内吞抑制剂处理后流式细胞仪测量A2780细胞对Dox-Origami Complex的胞吞影响。4.通过荷瘤裸鼠研究Dox-Origami Complex对卵巢癌的体内治疗效果。评估不同粒径Dox-Origami Complex的体内抑瘤效应。通过活体动物成像实验来研究纳米载体在体内的聚集情况。建立人卵巢癌裸鼠荷瘤模型,通过第1、4和9天、12天尾静脉注射生理盐水、游离Dox、Dox-big Origami Complex(100nmorigami), Dox-small Origami Complex(50nm origami),每2天裸鼠称重并测量每组肿瘤的体积。给药第14天后处死裸鼠,完整剥离肿瘤称重。取出纳米药物复合体治疗组裸鼠的心脏、肝脏和肾脏组织及肿瘤石蜡切片,HE染色观察。探讨纳米药物复合体的生物安全性,初步评估Dox-Origami Complex对人卵巢癌治疗的应用价值。实验结果1、通过热力学仿真计算分析不同设计折纸的热力学稳定性,根据稳定的折纸设计结果合成50nm、100nm粒径DNA折纸样本。通过凝胶电泳、原子力显微镜对不同粒径样品进行分析。1%琼脂糖凝胶可以看到清晰的DNA折纸条带,表明DNA折纸颗粒大小均一。通过原子力显微镜液相模式对折纸样本进行测试,分别在5um×5un,1.2um×1.2um, 1um×1um,0.5um×0.5um不同尺度下进行扫描分析,获得液相下DNA折纸样本的总体分布情况及稳定性,并直接测量单个折纸个体结构的大小,结果表明,DNA折纸技术可以通过DNA自组装形成传统大于100nnm粒径及50nm粒径的DNA折纸,形成的纳米折纸颗粒大小、形态均高度统一,结构稳定。2、DNA折纸对(多柔吡星)的载药及药物释放情况分析。分别测定18.25兆欧超纯水,0.5,1,1.5,2mM多柔吡星溶液在480nm处的吸收峰值,线性拟合测量值,标定线性相关系数R2=0.9998,表明多柔吡星溶液在0-2mM的测量浓度范围内具有良好的线性度,得到Dox摩尔消光系数,作为后续Dox浓度测量依据。两种粒径DNA折纸与多柔吡星室温孵育12、24、48、72小时,超滤离心分离游离Dox计算载药率,结果显示纳米载体荷载多柔吡星载药量随时间逐渐增加。100nnm粒径DNA折纸与多柔吡星在室温下培养48小时之后,约60%药物装载进DNA折纸。50nm粒径折纸经过48小时孵育后的载药量百分比达到50%。不同粒径Dox-Origami Complex分别在pH值6.0,7.5的PBS缓冲液中室温孵育1,2,5,10,24小时,超滤离心分离游离Dox测量药物释放量,结果显示纳米药物复合体的药物释放量随时间逐渐增加,药物释放与环境pH值呈负相关。最初的5个小时里,在生理环境中pH值为7.5的条件下,少于10%的药物从DNA折纸结构中释放了出来,24小时达到15%。在pH值为6的条件下,药物释放很快达到35%。对于50nm粒径DNA纳米折纸载体而言,pH值为7.5的条件下,5小时内少于10%的多柔吡星从DNA纳米药物复合体中释放出来,24小时内药物释放量不超过20%。在pH值为6的条件下,纳米药物复合体在10小时内药物释放量很快接近40%,24小时药物释放量达到45%。50nm粒径小DNA折纸载体对于环境pH值变化较传统折纸更为敏感,在酸性环境中的药物释放的效率比传统大粒径DNA折纸更为显著。3、卵巢癌细胞体外实验研究结果。不同粒径DNA折纸在不同浓度下与A2780细胞共孵育24,48,72小时后,肿瘤细胞存活率均在85%以上。CCK-8细胞增殖实验检测Dox-Origami Complex及游离Dox对细胞增殖抑制效应,按Dox浓度,分05μM、5μM、10μM、20μM、50μM短时间加药物刺激结果显示：0.5μM以下浓度24h各组间细胞存活率无显著性差异,随药物浓度稍有增加(5gM以上)或作用时间超过48小时,细胞活力显著下降,与游离Dox组差异有显著性,Dox-small Origami Complex组细胞活力最低。但超过20μM高浓度纳米载药复合体与游离药物对细胞影响无显著差异。提示超高药物浓度作用下纳米载体不增加药物效能,但较低浓度及较长作用时间时,纳米载体提高了原始药物的增殖抑制效应,卵巢癌细胞对Dox-Origami Complex更敏感。比较不同粒径Dox-Origami Complex的增殖抑制效应,按Dox浓度0.4 μM,0.8μM分组比较了6天的CCK-8实验细胞吸光度,绘制生长曲线,提示Dox-Origami Complex组自第三天起细胞活力明显下降,较游离Dox组抑制效应明显,Dox-small Origami Complex组抑制效应最强,0.8 μM组抑制效应更强。提示纳米载体可提高原始药物效能,粒径和药物浓度影响药物增殖抑制能力。细胞平板克隆形成实验表明相同低浓度的Dox处理12h,10天后Dox组、Dox-big origami complex 组、Dox-smallOrigami Complex组、small origami,big origami组的克隆形成数分别为对照组的37%,14%,3%和97.7%,98%。以游离药物Dox及不同粒径Dox-Origami Complex(相同Dox浓度0.5μM)作用于细胞36小时后,DAPI染色,在荧光显微镜下观察胞内定位及荧光强度,显示Dox-Origami Complex组胞内药物荧光强度较Dox组明显增强,Dox-small Origami Complex组胞内药物荧光强度最高。流式细胞仪分析了相同较高浓度(5μM)不同粒径Dox-Origami Complex及游离Dox对卵巢癌A2780细胞摄取的影响,作用24小时后,流式细胞术定量检测显示D ox-Origami Complex组较游离药物组细胞摄取药物荧光强度明显增加。以不同内吞抑制剂(氯丙嗪,EIPA, mβ-CD)作用后,流式细胞仪显示各组细胞摄取Dox的荧光强度分别下降了8%,13%和86%,提示小窝蛋白介导和巨胞饮可能是Dox-Origami Complex的主要胞吞途径。4、建立人卵巢癌裸鼠荷瘤模型。将荧光标记的cy5.5-origami按160u1的剂量(同0.08mg/kg)由尾静脉注射至荷瘤鼠体内后,小动物成像系统相同条件下分别观察注射前,注射后0.5h,2h,12h,24h,48h后的荧光分布情况,对照组用1ml注射器给BALB/cnu雌性小鼠尾静脉注射160μl含有cy5.5荧光染料的生理盐水。对照组起始12h内荧光主要集中在肝、肾脏和肿瘤等部位,随着时间的延长,肝、肾脏等的荧光慢慢减弱,48 h后基本消失,origami组肿瘤部位荧光一直较强,直到48 h荧光强度一直存在,提示DNA纳米折纸具有很好的肿瘤靶向性及滞留性。荷瘤鼠分组分别在第1、4和9天、12天尾静脉注射生理盐水、游离Dox、Dox-big Origami Complex、Dox-small origami complex组(以Dox剂量为同一标准,Dox按4mg/kg计算,相当于人体表面积20mg/m2)。给药后第14天,各组的肿瘤平均体积分别为(341.2±35.1)mm3,(201.6±19.5)mm3, (153.3±17.9) mm3, (98.3±10.2)mmm3。统计学分析采用SPSS12.0独立样本t检验,纳米药物组较游离药物组的肿瘤体积明显减小(P<O.01),Dox-small origami complex组的肿瘤体积缩小最明显(P<0.05)。荷瘤鼠平均体重分别为(23.1±1.15)g,(16.3±0.96)g,(21.9士1.19)g,(21.2±1.16)g。游离Dox组体重较生理盐水对照组重量明显降低(P<0.01),而Dox-Origami Complex组的体重变化较小。治疗结束后,摘除并测量裸鼠肿瘤组织的重量,各组的肿瘤平均重量分别为(340.9±17.2)mg,(201.2±10.15)mg,(153.1±7.80)mg,(97.8±5.2)mg。游离Dox、Dox-Origami Complex的肿瘤重量明显降低(P<0.01),Dox-small origami complex较其他各组的肿瘤重量最小(P<0.05)。对Dox-Origami Complex组裸鼠的心脏、肝脏和肾脏组织行病理检查结果提示均未见明显的组织学异常改变。提示Dox-Origami Complex对裸鼠心、肝、肾组织无明显影响。结论以DNA纳米技术构建的DNA折纸纳米药物载体粒径均一,形态可控,热力学效应稳定,药物装载效率高,并具备肿瘤微酸性环境相应性释放,以及良好的生物相容性；卵巢癌细胞对Dox-Origami Complex更敏感。DNA折纸纳米载药系统可提高化疗药物对卵巢癌治疗的靶向性。纳米药物复合体较游离药物显示了更好的治疗效果。相对于传统l00nm粒径折纸,本文研究的50nmm粒径DNA折纸是一种更有临床应用价值的卵巢癌治疗纳米载体。