研究背景：心脑血管疾病如冠心病、高血压、脑卒中、肺动脉高压等是人类健康的主要杀手。寻找其有效的干预措施,是关系国计民生的迫切需求。该组疾病病因复杂,大多由遗传及环境等多因素所致,但内皮完整性受损和内皮细胞功能障碍是该组疾病发生的早期关键环节。内皮细胞连接是内皮完整性的分子基础,在调节血管功能方面发挥了重要的作用。在多细胞生物中,细胞连接对于许多生物功能是必需的,如形态发生、细胞分化、增殖、凋亡和迁移。超微结构研究发现,内皮细胞有三种类型细胞连接,即间隙连接(GJs)、紧密连接(TJs)和粘附连接(AJs)。相邻细胞之间的GJs可以形成跨膜通道,而TJs和AJs则通过跨膜同嗜性粘附作用沿细胞边缘形成细胞外拉链结构。在三种内皮细胞连接中,AJs是其主要类型,钙粘蛋白(cadherins)和连接素(nectins)是已知的AJs之一。然而,针对这些已知分子的干预措施并不能完全阻断上述病理状态下的内皮通透性增加及完整性受损。CAT-1分子家族的第一个成员(小鼠CAT-1, mCAT-1)最初被鉴定为莫洛尼鼠白血病病毒受体(MuLVR)。氨基酸序列同源比较及氨基酸转运功能实验揭示CAT-1亦是一种钠离子依赖的阳离子氨基酸转运蛋白从而介导了阳离子氨基酸如L-arginine (L-Arg)的跨膜转运。L-Arg是细胞NO合成的唯一前体物质,在内皮细胞中CAT-1作为L-Arg的主要跨膜转运蛋白,通过介导胞外L-Arg的跨细胞膜转运从而增加内皮细胞NO产生浓度。NO是一多功能生物活性分子,它通过调节血管平滑肌张力、抑制白细胞及血小板与血管内皮粘附、抑制血管平滑肌细胞的增生及向内膜迁移,在维持血管生理功能中发挥重要作用。另外,NO通过调节多种血管介质影响血管内皮通透性调节,过量表达NO后会增加内皮通透性。最近研究显示,CAT-1在心血管系统疾病中发挥着重要作用,比如其过表达可以缓解氧化应激性内皮病理过程和肥胖导致的高血压等。但是,CAT-1对于血管内皮完整性的研究尚未有文献报道。鉴于过表达CAT-1可以增加内皮细胞NO的生成,而过量产生的NO又会增加内皮细胞通透性,因此我们猜想CAT-1过表达会增加内皮细胞通透性、损伤内皮完整性。但是,根据我们的预实验结果,CAT-1过表达增加了NO的生成,但是并没有增加内皮细胞通透性,相反,降低CAT-1表达后反而增加内皮通透性。因此,内皮细胞CAT-1可能通过一种不依赖于NO的其他机制参与了内皮稳定性调节,比如稳定内皮细胞连接等。因此,本课题旨在通过构建CAT-1/GFP融合蛋白,研究CAT-1通过何种机制维持了内皮通透性。研究目的：1、构建CAT-1/GFP融合表达蛋白,并评价该融合蛋白是否具有野生型CAT-1相一致的生物学功能；2、分析CAT-1是否通过稳定内皮细胞连接维持了内皮的完整性；3、验证CAT-1是否具有细胞粘附分子的生化特点及功能特征；4、探讨CAT-1转运底物L-Arg对其发挥氨基酸转运和细胞连接功能的影响。研究方法：第一部分：1.利用PCR方法从内皮细胞克隆获取CAT-1基因序列,将基因片段亚克隆至pENTR1A/GFP穿梭质粒形成CAT-1/GFP融合基因穿梭载体,然后采用Gateway LR重组技术构建获得腺病毒载体pAd-CAT-1/GFP和慢病毒载体pLenti-CAT-1/GFP,分别转染293A细胞和293FT细胞生产病毒,最后感染PAEC细胞和CHO-S细胞建立过表达CAT-1的细胞模型；2. CAT-1/GFP腺病毒感染猪肺动脉内皮细胞(PAEC),采用同位素方法检测L-Arg转运和NO生成,评价CAT-1/GFP融合蛋白是否具有野生型CAT-1一致的生物学功能；3.活细胞共聚焦显微镜观察CAT-1在PAEC细胞的表达及亚细胞定位；4. Western blot用以检测CAT-1/GFP的单体-二聚体(mono-dimer)形式；蛋白交联剂BS3处理CHO-S悬浮细胞,并通过Western blot检测CAT-1二聚体形式是反式(trans)还是顺式(cis)结合：5.建立稳定表达CAT-1/GFP融合蛋白的CHO-S细胞系,采用细胞凝集反应检测CAT-1是否具有促进细胞同源粘附的功能；第二部分：1.利用伊文氏蓝-白蛋白(EB-albumin)作为示踪剂,单层内皮细胞通透性实验用以分析CAT-1对内皮细胞通透性的影响；2.活体细胞共聚焦显微镜分析L-Arg处理对CAT-1介导的内皮细胞连接及其亚细胞定位的影响。研究结果：第一部分：1、酶切鉴定及序列测序分析证实CAT-1克隆序列以及CAT-1/GFP融合表达基因正确无误,并且成功包装了腺病毒和慢病毒；2、CAT-1/GFP融合蛋白具有与CAT-1一致的生物学功能成功提取并培养了PAEC细胞,经形态学观察及第八因子抗原染色(Ⅷ-RAg),细胞纯度大于95%；PAEC细胞过表达CAT-1/GFP后,与表达GFP对照细胞比较,其L-Arg转运能力增加了9倍(P<0.01),NO生成水平升高了5倍(P<0.01),说明重组的CAT-1/GFP融合蛋白具有与野生型CAT-1一致的功能；3、CAT-1蛋白主要定位在内皮细胞-细胞连接部位PAEC细胞表达CAT-1/GFP,利用共聚焦显微镜通过绿色荧光可以发现CAT-1/GFP主要定位在细胞-细胞连接部位,细胞核周围的荧光表示新生成的蛋白；CAT-1/GFP表达水平在48-72h达到高峰,可以维持至少7d；同时,免疫细胞荧光染色证实野生型CAT-1也有细胞-细胞连接部位的定位。提示CAT-1可能是一种细胞粘附分子。4、CAT-1蛋白具有反式同源二聚体的特点采用4-20%SDS-PAGE梯度分离胶分析蛋白样品,可见CAT-1/GFP有两种形式存在,一种是大小为190KD的二聚体形式,另一种是大小为95KD的单聚体形式,说明CAT-1/GFP可以发生同源二聚；而利用BS3蛋白交联剂处理单个悬浮CHO-S细胞,CAT-1/GFP蛋白条带是单一条带(95KD),表明CAT-1/GFP的同源二聚体形式是反式结合。说明CAT-1具有细胞粘附分子的生化特征。5、CAT-1蛋白具有促进悬浮CHO-S细胞同源粘附的功能用CAT-1/GFP及GFP对照慢病毒分别感染CHO-S细胞,blastidin抗生素筛选获得稳定表达细胞株,细胞凝集反应实验显示CAT-1/GFP表达细胞株比GFP表达细胞株更容易发生凝集现象(P<0.05)。除此之外,CAT家族其他几个成员,比如CAT-2b、CAT-3和CAT-4也具有促进细胞凝集反应的特点,而CAT-4不具有氨基酸转运功能,说明CATs家族促进细胞同源粘附与其氨基酸转运能力无关。进一步证实CAT-1是一种细胞粘附分子。第二部分：1.降低内皮细胞CAT-1表达水平增加内皮通透性利用小干扰RNA降低内皮细胞CAT-1表达后,EB-albumin通透率升高26±6%,与对照组细胞比较,有统计学意义(P<0.05)；而过表达CAT-1/GFP后,EB-albumin通透率降低趋势,但是没有统计学意义,可能机制是内皮细胞基底水平的CAT-1或其它粘附分子足以维持内皮细胞完整性；2. L-Arg处理会降低CAT-1内置、抑制内皮细胞CAT-1介导的细胞连接分离给予内皮细胞1mM剂量的L-Arg处理后,与对照组细胞比较,CAT-1/GFP组细胞CAT-1内置降低,细胞-细胞连接分离明显减慢,L-Arg转运能力明显增加(P<0.01),并且同时有CAT-1的膜转位现象发生。这些实验结果说明L-Arg具有稳定内皮细胞连接的功能,同时也为解释氨基酸悖论(L-Arg paradox)和反式刺激(trans-stimulation)现象提供了新的依据。研究结论：1.融合蛋白CAT-1/GFP具有与野生型CAT-1一致的生物学功能,因此可利用抗GFP抗体和绿色细胞荧光研究CAT-1蛋白的亚细胞定位和功能；2.CAT-1是一种新的细胞粘附分子,通过稳定内皮细胞-细胞连接维持了内皮的完整性；3. L-Arg通过抑制CAT-1蛋白内置稳定了CAT-1介导的内皮细胞-细胞连接：4. L-Arg抑制CAT-1内置以及促进细胞游离面CAT-1表达,揭示了氨基酸反式刺激和L-Arg悖论现象的新机制。