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二硫化碳(Carbon disulfide, CS2)是一种应用广泛的有机溶剂,主要用于橡胶的硫化、谷物蒸熏、石蜡、石油的精炼以及粘胶纤维的制造等。CS2为多系统毒物,其对神经系统、心血管系统、视觉系统和生殖系统的影响已有报道。CS2对男(雄)性生殖系统的影响主要表现为性功能由亢进到减退,精子数减少,活力下降和畸形精子数增多等。本实验室在前期的动物实验中发现,CS2可引起雄性大鼠血清性激素水平发生改变,导致雄性大鼠下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic-pituitary-gonad axis, HPGA)功能紊乱。性激素的分泌主要受HPGA的调节,通过一系列正反馈及负反馈作用来调节激素的分泌,使外周血激素的水平保持相对稳定,对维持生殖系统脏器发育、生殖功能及第二性征具有重要作用。一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是一种兼有第二信使、神经递质和效应分子等多种生理功能的生物信号分子,在生物体内发挥着十分重要的作用。NO广泛分布于男性生殖系统的各个器官,对生殖的调节作用具有双重性。研究表明,NO参与了整个HPGA的平衡调节,NO合成的多寡是机体生殖内分泌功能紊乱的重要步骤。本实验室前期研究发现CS2可造成雄性大鼠睾丸组织的氧化损伤,导致睾丸组织中NO含量、总一氧化氮合酶(NOS)活力和诱导型NOS(iNOS)活力下降,因而推测,NO可能在CS2导致的HPGA功能紊乱的过程中发挥重要作用。目前,有关CS2对男(雄)性HPGA影响的研究鲜有报道,其具体的分子调控机制尚不清楚。本项目以CS2为受试物,以HPGA为研究对象,将职业人群调查、整体动物实验和体外细胞培养相结合,探讨CS2对男(雄)性HPGA功能的影响及其机制,并探讨NO供体硝普钠(Sodium Nitroprusside, SNP)和总NOS抑制剂N-甲基-L-精氨酸(NG-Monomethyl-L-arginine,L-NMMA)的干预作用,为进一步阐明NO对生殖内分泌的作用,丰富对CS2致男(雄)性生殖损伤分子机制的认识提供科学依据。第一部分CS2职业接触人群调查研究一、CS2职业暴露对男工性功能和生殖结局的影响目的：探讨CS2对接触男工性功能及生殖结局的影响。方法：对276名CS2暴露男工和126名非CS2暴露男工的基本情况、性功能及其配偶生殖结局进行调查研究。结果：性功能调查结果显示,CS2暴露组男工性生活和谐比例及性生活频度降低,性生活厌恶感增加(P<0.05)；各组间男工妻子妊娠并发症发生率无统计学差异(P>0.05)。生殖结局调查结果表明,混合组(夫妻双方均接触CS2)的自然流产率与单纯组(只有男工接触CS2而其妻子不接触)和对照组比较均具有统计学差异(P<0.05)；混合组与对照组比较,子代低出生体重发生比例增高(P<0.05),子代智力发育及生长发育无统计学差异(P>0.05)。结论：CS2职业暴露可导致男性性功能障碍和不良生殖结局,但对子代的智力和生长发育影响不明显。二、CS2职业暴露对男工血清性激素水平的影响目的：探讨CS2对职业接触男工血清性激素水平的影响。方法：选择工龄、文化程度、生活条件等基本情况相似的CS2暴露男工63名和非CS2暴露男工69名,对其血清GnRH、FSH、LH和T水平进行检测。结果：工龄2～8年的CS2暴露组男工,血清T和LH水平明显高于对照组(P<0.05);工龄8年以上的CS2暴露组男工,血清T、FSH、GnRH水平明显高于对照组,具有统计学差异(P<0.05)。结论：职业接触CS2可导致男性生殖内分泌功能紊乱,血清LH水平首先发生改变,可作为反映CS2生殖损伤的早期指标。第二部分CS2对大鼠下丘脑-垂体-性腺轴超微病理结构的影响以及NO的干预作用目的：探讨CS2对雄性大鼠下丘脑-垂体-性腺轴超微病理结构的影响及NO的干预作用。方法：36只雄性SD大鼠随机分为6组,以不同浓度CS2(0、50、250、1250 mg/m3)静式吸入染毒,共10周,另设CS2(1250 mg/m3)+SNP(5mg/kg)和CS2(1250 mg/m3)+L-NMMA(2mg/kg)干预组,SNP和L-NMMA从动物染毒结束前10 d开始腹腔注射,1次/d。染毒结束后,采用透射电镜观察大鼠下丘脑、垂体和睾丸组织超微病理结构的改变。结果：CS2染毒可造成下丘脑神经元、垂体促性腺激素细胞、生长激素细胞和睾丸支持细胞线粒体肿胀,内质网扩张,NO供体对CS2引起的下丘脑、垂体、睾丸组织的损伤具有拮抗作用,而NOS抑制剂则进一步导致病变的发生。结论：CS2可造成下丘脑、垂体和睾丸组织超微病理结构的改变,NO在这过程中发挥重要作用。第三部分大鼠下丘脑神经元和垂体前叶细胞体外培养方法的建立一、新生大鼠下丘脑神经元原代培养和鉴定目的：探讨大鼠下丘脑神经元体外培养技术。方法：选用新生SD大鼠,取下丘脑组织进行单细胞原代培养,倒置显微镜下动态观察培养细胞在体外生长的情况,并采用尼氏染色法对体外培养的神经元进行鉴定。结果：培养3d时观察发现下丘脑神经元具有双极突起,突起较短；培养7d时神经元突起长度达到最高峰；尼氏染色可见胞质内有颗粒状的尼氏体,呈深蓝色。结论：本实验室采用的大鼠下丘脑神经元原代培养方法能够为开展神经内分泌的分子生物学研究提供理想的体外实验模型。二、大鼠垂体前叶细胞体外培养和鉴定目的：探讨大鼠垂体前叶细胞体外培养技术。方法：选用成年雄性SD大鼠,取垂体前叶进行单细胞原代培养,倒置显微镜下动态观察培养细胞在体外生长的情况,并采用免疫细胞化学染色技术对垂体前叶细胞LH和FSH分泌细胞进行鉴定。结果：垂体前叶细胞呈圆形,折光性较强,成纤维细胞生长明显,原代培养后期成纤维细胞已为主要细胞。免疫细胞化学染色结果显示,LH和FSH免疫阳性细胞胞浆呈棕黄色。结论：体外培养的垂体细胞中有多种细胞的生长,反复差速贴壁法能较好的去除成纤维细胞,提高垂体前叶细胞的纯度,但LH和FSH免疫反应阳性细胞比例较低。第四部分CS2致雄性大鼠下丘脑-垂体-性腺轴功能紊乱机制的研究一、CS2对大鼠下丘脑-垂体-性腺轴激素和激素受体mRNA表达水平的影响以及NO的干预作用目的：探讨CS2对大鼠下丘脑-垂体-性腺轴激素和激素受体mRNA表达水平的影响以及NO的干预作用方法：对体外培养的大鼠垂体前叶细胞进行染毒,共设6个染毒组,分别为对照组、3个不同浓度CS2染毒组(2.5、5.0、10.0μmol/ml CS2)、SNP干预组(10.0μmol/ml CS2+20μmol/ml SNP)和L-NMMA干预组(10.0μmol/ml CS2+50μmol/ml L-NMMA),支持细胞的6个染毒组分别为对照组、3个不同浓度CS2染毒组(1.25、2.50、5.00μmol/ml CS2)、SNP干预组(5.00μmol/ml CS2+10μmol/ml SNP)和L-NMMA干预组(5.00μmol/ml CS2+25μmol/ml L-NMMA),采用Real-time PCR对垂体前叶细胞中GnRHR mRNA和睾丸支持细胞中FSHR、ABP、INH mRNA表达水平进行检测。结果：垂体前叶细胞中GnRHR mRNA表达水平在10.0μmol/ml CS2染毒时显著降低(P<0.05),NOS抑制剂L-NMMA可拮抗CS2的作用,使GnRHR mRNA表达水平显著增高(P<0.05)；在睾丸支持细胞中,不同浓度CS2染毒组与对照组比较,ABP和INHαmRNA表达水平没有明显变化(P>0.05),5.0μmol/ml CS2染毒组FSHR和INHpb mRNA表达水平显著降低,INHpa mRNA表达水平显著增高(P<0.05)；NO供体SNP干预组与5.0μmol/ml CS2染毒组比较,INHa mRNA表达水平显著增高(P<0.05),ABP、FSHR、INHβa和INHβb mRNA表达水平改变均不明显(P>0.05)；NOS抑制剂L-NMMA干预组与5.0μmol/ml CS2染毒组比较,ABP mRNA表达水平显著增高(P<0.05),FSHR、INHα、INHβa和INHβb mRNA表达水平改变均不明显(P>0.05)。结论：CS2可抑制垂体前叶细胞中GnRHR、支持细胞中FSHR和INHβb的表达,通过抑制HPGA中多种激素和激素受体的合成,导致HPGA功能紊乱,CS2对垂体GnRHR的抑制作用与NOS活性有关。二、CS2对大鼠下丘脑神经元、垂体前叶细胞和睾丸支持细胞内cAMP/cGMP的影响以及NO的干预作用目的：探讨CS2对大鼠下丘脑神经元、垂体前叶细胞和睾丸支持细胞内cAMP/cGMP的影响以及NO的干预作用。方法：对体外培养的大鼠下丘脑神经元和垂体前叶细胞进行染毒,共设6个染毒组,分别为对照组、3个不同浓度CS2染毒组(2.5、5.0、10.0μmol/ml CS2)、SNP干预组(10.0μmol/ml CS2+20μmol/ml SNP)和L-NMMA干预组(10.0μmol/ml CS2+50μmol/ml L-NMMA),支持细胞的6个染毒组分别为对照组、3个不同浓度CS2染毒组(1.25、2.50、5.00μmol/ml CS2)、SNP干预组(5.00μmol/ml CS2+10μmol/ml SNP)和L-NMMA干预组(5.00μmol/ml CS2+25μmol/ml L-NMMA),采用酶联免疫吸附试验对下丘脑神经元、垂体前叶细胞和睾丸支持细胞中cAMP和cGMP水平进行检测。结果：下丘脑神经元中,各染毒组cAMP水平变化不明显(P>0.05),cGMP水平在10.0μmol/ml CS2染毒组显著降低,SNP可拮抗CS2的作用,使cGMP水平显著增高(P<0.05)；垂体前叶细胞中cAMP和cGMP水平不随CS2染毒浓度的增加而发生改变(P>0.05),但L-NMMA干预组与10.0μmol/ml CS2染毒组比较,细胞中cAMP和cGMP水平均显著增高(P<0.05)；睾丸支持细胞中各染毒组cAMP和cGMP水平均无明显改变(P>0.05)。结论：CS2可明显降低大鼠下丘脑神经元中cGMP水平,并能被SNP拮抗,但对垂体和睾丸cAMP和cGMP没有影响,提示CS2可能通过NO-cGMP途径影响下丘脑分泌功能,而CS2对垂体和支持细胞分泌功能的影响则不依赖于cAMP和cGMP。