目前,多粘菌素是治疗多药耐药革兰阴性菌的“最后一道抗菌防线”。然而,由于抗生素的不合理使用,对多粘菌素产生耐药的革兰阴性菌日益增多。因此,我们亟需深入了解多粘菌素耐药性的形成机制,以期为抗细菌感染新药的研发提供新的思路和药物。目前研究表明,多粘菌素的主要作用靶点为革兰阴性菌外膜上的脂多糖。与脂多糖中脂质A的磷酸基团结合后,多粘菌素进入细胞周质,进而发挥抗菌机制。多粘菌素的抗菌机制主要有以下三种假说:膜裂解假说、磷脂交换假说和羟基自由基致死假说。多粘菌素的耐药机制在革兰阴性菌中逐渐被报道,主要如下:(1)脂多糖结构的改变,导致脂多糖所携带的净负电荷减少;(2)基因突变;(3)多药耐药外排泵的过表达;(4)外膜孔蛋白的改变;(5)荚膜的形成。在这之中,arn操纵子调控的4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖(L-Ara4N)对脂多糖修饰在铜绿假单胞菌中最为常见。本论文以铜绿假单胞菌作为主要模型,对多粘菌素耐药机制作进一步的研究。我以对多粘菌素具有高度耐药性的铜绿假单胞菌临床分离株DK2(MIC=256μg/ml)为研究模型,筛选对多粘菌素敏感的突变体和可增效多粘菌素抗菌效果的化合物。DK2是一种多重耐药细菌,给遗传操作带来一定的困难。首先,我对转座子插入诱变系统pBT20进行了改造,成功获得可用于DK2菌株的转座子插入诱变质粒pBT20-TET-1。在成功建立了突变体文库(大约包含了20000个突变体菌株)后,我筛选对多粘菌素变敏感的插入突变体,最终发现15个基因的转座子插入分别导致DK2的多粘菌素耐药性显著降低(MIC≤4μg/ml)。这15个基因分别为arn操纵子中的组成基因、与脂多糖合成相关的基因、PA4029、PA1064和PA3800(bamB)。通过功能互补实验,我确证了编码外膜蛋白组装因子基因bam B对DK2菌株的多粘菌素耐药性起着重要的作用。在DK2菌株和实验室常用的标准菌株MPAO1中,bamB的缺失均不会影响脂多糖的生成,但能增加外膜渗透性。除此之外,bamB的缺失在DK2中并不会引起外膜蛋白的改变,而在MPAO1中有相应的外膜蛋白发生了变化;对于分泌蛋白,bamB的缺失在DK2和MPAO1中均有不同程度的变化。除了筛选突变体文库外,我还对药物库进行筛选,以期发现可增强多粘菌素抗菌效果的药物。研究发现氯硝柳胺、利福平、利福布汀、利福昔明、NH125、IMD-0354可显著增加多粘菌素的抗菌效果。同时,我检测了化合物联用多粘菌素对arn操纵子表达的影响,发现化合物NH125联用多粘菌素能有效抑制arn操纵子表达。我还发现除了氯硝柳胺之外,其他5个化合物联用多粘菌素均能使脂多糖含量产生一定程度的减少。综上所述,我在基因组的水平上分析了多粘菌素高度耐药铜绿假单胞菌DK2的遗传基础,筛选出一些可增强多粘菌素抗菌效果的化合物,为深入研究多粘菌素耐药性的分子机制奠定了基础。