在现代养猪业中,仔猪腹泻一直是行业从业人员及科研人员关注的焦点问题。仔猪腹泻的主要原因主要在于病原微生物感染、胃肠道消化、屏障、免疫功能不完善、断奶应激等等。抗微生物肽（antimicrobial peptides,AMPs）是一类具有抗细菌、真菌、抗病毒的多肽分子,因其具有广谱抑菌活性且不易产生耐药性而被认为是潜在的抗生素替代物。研究表明,部分抗微生物肽不仅具有抗菌活性,还具有调控免疫、损伤修复、增强皮肤及肠道等上皮组织细胞屏障功能等作用。本课题通过建立DSS诱导的肠炎小鼠模型及E·coli感染的细胞模型,探究cecropin A的抑菌活性、代谢时间、最佳治疗剂量及相关机制。主要的试验结果如下:试验一:使用抗微生物肽数据库筛选出7种备选抗微生物肽,经人工合成后,检测其对于大肠埃希氏菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌等肠炎相关的致病菌的抑菌活性。利用MTT比色法检测不同浓度的抗微生物肽对细胞活力的影响。结果表明,cecropin A针对革兰氏阴性菌MIC和MBC为3.125-6.25μg/m L,抑菌活性较好,且在较低浓度3.125-12.5μM浓度范围内对细胞活力无负面影响。其余抗微生物肽在较低剂量也会降低细胞活力,且呈现剂量依赖型。试验二:为了探究cecropin A在体内的存留时间及代谢情况,将游离FITC、FITC-cecropin A（利用FITC在肽链的N端进行标记）分别注射入裸鼠体内,在不同时间点（15min、1h、2h、4h）用小动物成像仪检测并比较小鼠体内的荧光的分布及强度。结果表明,FITC-cecropin A及FITC经腹腔吸收后,在15min内即可随血液分布于全身。1-2h时间段内,cecropin A组小鼠体内的荧光强度逐渐从全身消退至腹部,2h时全部消失,而FITC组的荧光始终分布于全身。表明cecropin A能够在体内以完整分子的形式发挥作用后才被排出体外。试验三:为了探究cecropin A的是否可能对小鼠产生负面影响,我们将36只C57B/6小鼠分为对照组、5、15、30mg/kg剂量组,每组9只。对照组小鼠腹腔注射生理盐水,试验组根据小鼠体重分别注射不同剂量的cecropin A,共注射5天。结果表明,5、15 mg/kg cecropin A对小鼠主要器官如心、肝、脾、肾无负面影响,能够促进回肠绒毛高度隐窝深度比及结肠隐窝深度（P<0.05）,对血清中乳酸脱氢酶（LDH）、谷草转氨酶（AST）及碱性磷酸酶无显著影响;腹腔注射30mg/kg cecropin A能够显著提高肝脏指数（P<0.05）。H&E染色结果表明,30mg/kg组小鼠的肝脏结构发生改变,部分肝脏细胞出现空泡形态,且边界散乱,结构不规则。血清指标检测表明,AST、AKP的含量有显著提高的趋势（0.05<P<0.1）,结果提示,腹腔注射适当剂量cecropin A不会对小鼠器官产生负面影响,且能够促进肠道发育,而高剂量cecropin A可能对小鼠肝脏产生负面作用,且不能促进肠道发育。试验四:为了探究cecropin A对于肠炎（inflammatory bowel disease,IBD）的治疗作用,筛选合适的治疗剂量,基于试验三,将36只C57BL/6小鼠分为control、5mg/kg cecropin A、15mg/kg cecropin A及DSS组,每组9只。首先在小鼠饮水中添加高剂量（4%）DSS（5天）诱导致死性肠炎。诱导5天后,抗微生物肽治疗组分别按小鼠体重腹腔注射5mg/kg、15mg/kg cecropin A进行治疗,DSS组及control组注射生理盐水作为对照。每天统计体重、腹泻率、出血率、生存率,并观察小鼠的精神状态。结果表明,与DSS相比,5mg/kg cecropin A组的生存率、体重无显著差异（P>0.05）,而腹腔注射15mg/kg cecropin A能够极显著提高小鼠的生存率（P<0.01）。5mg/kg及15mg/kg剂量均能够显著改善小鼠结肠长度、体重、腹泻、出血和疾病指数（P<0.05）。H&E染色及肠道形态学分析表明,15mg/kg cecropin A能够显著改善肠道上皮的形态结构,结果表明,15mg/kg cecropin A是对于DSS诱导肠炎较优的治疗剂量。试验五:为了探究cecropin A与抗生素治疗效果的异同,基于试验四,将36只C57BL/6小鼠分为control组、DSS组、DSS+cecropin A组,DSS+gentamicin组。其中,DSS组、DSS+cecropin A组及DSS+gentamicin组均在饮水中添加2.5%的DSS处理5天诱导较为温和的肠炎模型,5天后换为正常水。同时,DSS组腹腔注射生理盐水;DSS+Cecropin A及DSS+gentamicin组分别按体重注射15mg/kg cecropin A或5mg/kg gentamicin（3天）。期间每天对小鼠称重并统计腹泻及出血分数。结果表明,cecropin A及gentamicin均能够显著改善IBD小鼠的体重减轻、腹泻指数、出血分数及疾病分数（P<0.05）。此外,与gentamicin相比cecropin A能够显著改善结肠长度（P<0.05）。H&E染色及肠道形态学分析表明,2.5%DSS组小鼠的回肠及结肠上皮结构被严重破坏,cecropin A及gentamicin均能够改善肠上皮形态,提高紧密连接蛋白表达量。利用ELISA、western blotting的方法检测各组小鼠结肠组织肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（interlukin-1β,IL-1β）、白细胞介素6（interlukin-6,IL-6）及MAPK（p38,c-jun）、NF-κB（p65）信号通路相关蛋白的磷酸化水平,结果表明,二者均能够降低促炎症因子的表达量（P<0.05）,降低炎症相关信号通路蛋白的磷酸化水平（P<0.05）。此外与gentamicin组相比,cecropin A的肠上皮结构恢复更加完整,紧密连接蛋白claudin-1,occludin的表达量显著提高（P<0.05）。试验六:为了探究cecropin A与庆大霉素对小鼠肠道菌群调控作用的异同,基于试验五,收集control组、DSS组、DSS+cecropin A及DSS+gentamicin治疗组小鼠的盲肠内容物,利用16s r RNA基因测序技术结合生物信息学方法,分析肠炎及不同治疗药物对肠道菌群的影响。结果表明,cecropin A及gentamicin显著降低了肠炎小鼠肠道内容物中拟杆菌科、肠杆菌科的相对丰度,抑制炎症的表达（P<0.05）,进而缓解肠炎。此外,不同药物对肠道菌群的调控作用不同。Cecropin A能够显著提高乳酸杆菌属的相对丰度,而gentamicin则显著提高梭菌纲及脱硫弧菌科的相对丰度（P<0.05）。试验七:为了探究cecropin A是否能够直接调控肠上皮细胞的屏障功能,基于试验一和试验七,我们选择猪肠上皮细胞系IPEC-J2为模型研究cecropin A缓解肠炎的潜在机制。结果表明使用12.5mg/m L浓度cecropin A处理细胞48h后,能够显著减少E·coli（W25K）的粘附。利用q PCR检测TNF-α、IL-6、IL-8的m RNA表达水平,结果表明经cecropin A处理后,由E·coli引起的促炎症因子表达受到显著抑制（P<0.05）。将细胞接种于transwell板上,用cecropin A分别处理24h、48h、72h,结果表明,12.5mg/m L浓度cecropin A处理细胞48h、72h,能够显著提高单层细胞电阻（transepithelium electric resistance,TER）值,降低对大分子（FITC-dextran）的通透性。Western blotting结果表明,cecropin A能够上调紧密连接蛋白ZO-1、occludin及claudin-1的蛋白表达量。细胞免疫荧光结果表明,cecropin A处理组紧密连接蛋白及细胞骨架F-actin向细胞膜聚集。同时,结果表明,MEK/ERK信号通路被抑制,其下游的转录因子CDX2蛋白表达量提高。为了证明抑制MEK/ER信号通路能够调控肠上皮细胞屏障功能,设置DMSO、DMSO+cecropin A、PD184352+cecropin A组,分别处理24h、48h,结果表明,特异性抑制剂PD184352在完全抑制ERK磷酸化后,与DMSO、cecropin A组相比,显著提高单层细胞的TER值（P<0.05）、紧密连接蛋白的表达量显著提高（P<0.05）且紧密连接蛋白与F-actin向细胞膜聚集,表明抑制ERK能够调控紧密连接蛋白-细胞骨架的表达量及分布,从而调控肠道屏障的功能。综上所述,cecropin A具有良好的杀菌作用。在小鼠体内的存留时间不超过1h,但长期高剂量连续腹腔注射可能有潜在损伤肝脏功能的作用。腹腔注射适量的cecropin A能够有效缓解DSS诱导的肠道炎症。除杀菌作用外,cecropin A还能够通过抑制MER/ERK信号通路,增强肠上皮细胞屏障的功能,从而减少病原微生物的粘附与侵袭。