流行性乙型脑炎简称乙脑,是由黄病毒科黄病毒属的乙脑病毒(也称日本脑炎病毒,Japaneseencephalitis virus,JEV)引起、由蚊虫传播的一种急性病毒性传染病,主要侵害中枢神经系统,对人类健康威胁很大。对猪可引起繁殖障碍,给养猪业造成巨大的经济损失。猪是JEV的中间宿主,带毒猪是本病的主要传染源。因此,控制猪的JE不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。E蛋白是JEV的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。本研究首先利用原核表达的乙型脑炎病毒SA14-14-2株结构蛋白E蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,经有限稀释法共获得15株特异性针对JEV E蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为1A9、1G12、1H2、2A6、2B3、2G3、3D1、4E6、4H1、5B3、5B7、5D4、5D7、5G11、5G12,经测定5B7单抗亚类属于IgG2b,5D4和5G12的单抗亚类属于IgG2a,其余12株均为IgGl,轻链均为κ链。经Western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体均可特异地与JEV E蛋白反应。结果表明,所制备的抗重组JEV E蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性,为JEV准确快速的病原诊断和JEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。由于鼠源性单抗在治疗时引起了严重的HAMA(human anti-mouse antibody)反应,限制了临床的运用,为了克服鼠源MAb的免疫源性,使之和人体分子有非常相似的轮廓,从而逃避人免疫系统的识别,降低或避免诱导HAMA反应。采用基因工程方法制备单链抗体免除了杂交瘤技术繁杂的筛选过程,拓宽了抗体的应用范围,大大推进了抗体工程的进展。本试验从分泌抗乙脑病毒E蛋白特异性单抗的杂交瘤细胞株5D4中提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆抗乙脑病毒E蛋白单抗5D4 VH基因,并将其插入pMD18-T载体中进行测序分析。VH基因全长328 bp。通过分析,这些基因均符合小鼠IgG V区基因的特征,含有4个框架区、3个抗原互补决定区,而且抗体特征性的半胱氨酸残基的数量和位置也正确。为下一步构建多种形式的基因工程抗体奠定了良好的基础。