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来自于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)中的短链脱氢酶(S)-羰基还原酶II(SCRII)在辅酶NADPH的参与下,能够特异性催化2-羟基苯乙酮合成(S)-苯基乙二醇,但催化效率较低、热稳定性不高。本研究利用sortase A(SrtA)的转肽作用,通过在SCRII的C末端引入SrtA识别序列,在SrtA的介导下构建功能和稳定性均加强的SCRII寡聚体。以2-羟基苯乙酮作为底物,NADPH作为辅酶,SCRII寡聚体为催化剂高效制备(S)-苯基乙二醇。随后,将SrtA介导的寡聚化扩展至其它8种羰基还原酶,建立了增强羰基还原酶稳定性,提高酶催化效率的平台技术。主要研究内容包括:(1)从金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ST451的基因组中钓取SrtA基因核心序列并构建pET21a-srt A质粒,实现了SrtA在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的高效表达;通过设计引物在SCRII的C末端引入GGGGSLPETGG序列,构建pET28a-scr II-mtf质粒,诱导表达结果表明加入GGGGSLPETGG标签对酶的表达没有影响;优化了SrtA介导SCRII-mtf连接的条件,当SrtA的酶浓度为1 mg·m L-1的情况下,Ca2+的最佳浓度为10 mmol·L-1,连接反应的最佳温度为25℃,连接时间为36 h时,几乎所有的SCRII-mtf都被消耗,此时连接产物产量最高,且连接产物成分主要为二聚体和三聚体。(2)测定了SCRII寡聚体的酶学性质,在35℃,pH 6.0的条件下,SCRII-mtf较SCRII酶活有略微提高,而SrtA介导产生的SCRII寡聚体对2-羟基苯乙酮的比活达到了38.5 U·mg-1,与SCRII相比提高了6倍;SCRII寡聚体在50℃时相对酶活最高,SCRII寡聚体和SCRII在50℃放置1 h,活性分别维持在90%以上和50%左右,表明SCRII寡聚化后,温度稳定性显著提高;SCRII、SCRII-mtf和SCRII寡聚体对于pH的依赖性非常相似,但SCRII寡聚体的pH稳定性明显高于其它两种酶;与SCRII相比,SCRII寡聚体的Km值降低了3.3倍,说明经过寡聚化,SCRII寡聚体与底物2-羟基苯乙酮的亲和力有所增加。(3)确定了SCRII寡聚体生物转化(S)-苯基乙二醇的最适反应条件,从整体上来看,SCRII寡聚体在35℃,pH 6.0,5g·L-1 2-羟基苯乙酮的条件下,2 h内SCRII寡聚体转化生成(S)-苯基乙二醇的产率高达90%以上;在3 h内生成(S)-苯基乙二醇的产率和光学纯度均达到了100%。(4)选取了另外8种氧化还原酶,利用SrtA构建氧化还原酶寡聚体,8种寡聚体在SrtA的介导下均出现不同程度的寡聚化,圆二色谱显示寡聚体的Tm值较原始酶升高了5℃-12℃,寡聚体酶活力较单体提高了5-11倍,生物转化反应6 h后,对应手性产物的产率提高了25%-285%。