谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶(Glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT)是己糖胺生物合成途径的限速酶,主要位于胞质内,在不同物种间较为保守。己糖胺合成途径作为能量的感受器,可以整合葡萄糖、氨基酸、脂质和核苷酸代谢等代谢途径。己糖胺合成途径的终产物UDP-GlcNAc参与了糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂等物质的合成,在细胞中的生物学意义非常重要。在昆虫中,己糖胺合成途径又是几丁质代谢的组成部分。柞蚕作为我国特有的一种重要绢丝类昆虫,它的生长发育离不开能量代谢和骨骼重塑。柞蚕体壁的外表层和内表层由几丁质与蛋白质组成,柞蚕干蛹中的几丁质质量分数约占2.8%。但是该合成途径还未在柞蚕中发现,GFAT作为该途径的重要节点,对其研究发现有重要意义。磷酸化是调节GFAT活性的重要方式,在人源、小鼠,果蝇等不同物种中均有GFAT磷酸化报道。该蛋白由于活性不稳定,其在真核表达体系中大量表达、纯化一直成为难点。本研究旨在利用柞蚕核型多角体病毒表达体系,表达、纯化出具有活性的柞蚕谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶(ApGFAT)。首先从柞蚕转录组数据库中,获得柞蚕ApGFAT的cDNA序列。经实时定量PCR检测ApGFAT的mRNA在不同组织中的表达,结果表明该基因在不同组织中表达差异显著,在精巢中的表达量远远高于其他组织。经生物信息学分析,结果表明,柞蚕ApGFAT的cDNA片段由2025个碱基构成,编码674个氨基酸,蛋白分子量约为75.5kDa,不具有信号肽结构。通过疏水聚类分析和三维结构叠合比对发现,GFAT蛋白在不同物种间高度保守,柞蚕ApGFAT与人源GFAT蛋白结构类似,由谷氨酰胺结构域和糖异构酶结构域两个结构域组成。然后提取柞蚕蛹总RNA,反转录合成cDNA文库,成功克隆柞蚕ApGFAT的cDNA片段。将该片段插入到ApNPV转移载体pApBacDual-ApGFAT,转化改造的大肠杆菌DH10Bac,获得重组杆粒。提取杆粒DNA,转染Tn-High 5细胞,筛选出带有目的基因的重组病毒。用该病毒注射柞蚕蛹,发病7-10天后收集血淋巴利用His抗体进行免疫印迹分析,结果表明ApGFAT重组蛋白在蛹体内得到表达。经His亲和柱纯化得到了ApGFAT重组蛋白,活性为0.978μmol/(min·mg)。本研究克隆了柞蚕GFAT基因并实现了在柞蚕蛹中的表达,为后续开展柞蚕己糖胺途径和几丁质合成等方面的研究奠定基础。