第一章绪论本文主要包括三部分内容：分子信标技术、主客体识别技术以及本论文的设计目的及意义。首先,对分子信标的相关背景知识做了阐述,包括分子信标的结构与原理,分子信标的分类、应用及研究进展,分子信标的展望。其次,对主客体识别技术的原理及在电化学生物传感器中的应用做了详细介绍。最后,基于前面两部分内容,详细阐述了基于主客体识别的新型电化学活性开关分子信标CB[7]/Fc-MB的设计理念,目的意义以及创新之处。第二章新型电化学活性分子信标(Fc-MB)的研制与表征大部分传统的电化学分子信标都是固定在电极表面,虽然检测迅速方便,但仍然存在一些因信标固定在电极表面所带来的问题,例如因信标固定密度差异造成的检测不准确性以及重现性较差等问题。因此,研制设计不需要固定在电极表面,能直接在均相溶液中对目标物高效灵敏地进行检测的电化学分子信标将是未来的研究趋势。在本文中,我们设计了一种新型电化学活性分子信标——Fc-MB,在茎环结构的MB两端标记上二茂铁基团,制得Fc-MB。本实验中,首先我们通过酯化反应合成FcCO-NHS酯,并对其进行充分纯化及表征；然后,再将FcCO-NHS酯与MB(两端修饰了氨基)通过酰胺反应制得Fc-MB,并对其进行充分纯化及表征,同时对纯化过程采用HPLC及紫外可见吸收光谱法进行监测。实验结果表明,我们合成的FcCO-NHS酯和Fc-MB产率及纯度均较高。第三章基于主客体识别新型电化学活性开关分子信标(CB[7]/Fc-MB)的性质探究随着主客体识别技术的蓬勃发展,主体分子与客体分子之间的包络现象及包络机理也随之成为广大研究工作者的研究热点。有许多方法用于确证主客体包络现象,例如可以用NMR、X射线衍射法、荧光光谱法、紫外-可见吸收光法等,其中,以紫外-可见吸收光谱法最为简便。本文在对CB[7]、β-CD分别与二茂铁客体分子的包络作用机理以及包络物结构的详细分析基础上,选择将主体分子CB[7]与我们成功研制的电化学活性分子信标Fc-MB相结合,构建基于主客体识别的新型电化学活性开关分子标CB[7]/Fc-MB,并探究其相关性质。本实验中,主要对主体分子CB[7]与客体分子二茂铁衍生物(FcCOOH)的包络情况进行探究,并用紫外可见吸收光谱法对其进行表征,采用摩尔比率法计算其包络常数为5×105,这低于CB[7]/Fc的包络常数,这是因为二茂铁基团上任何的修饰以及供价取代基团都可能影响CB[7]与二茂铁客体分子之间的主客体识别作用,从而降低其包络常数。随后,我们采用电化学方法探究了二茂铁基团上的取代基对其电化学活性的影响,由实验结果可看出,各取代基对二茂铁基团的电化学活性的影响,相对于FcCOOH来说,同等条件下,Fc-MB较难被氧化。最后,我们研究了Fc-MB的热稳定性质,测得Tm值约为78℃。与没有标记二茂铁的MB的Tm值56℃相比,这表明双标记二茂铁基团的信标Fc-MB的热稳定性明显增强。所以,我们研制的具有较高热稳定性的分子信标Fc-MB,可以有效的避免假阳信号,可以进一步提高检测灵敏度,为将Fc-MB应用于基因检测领域奠定了基础。第四章基于主客体识别新型电化学活性开关分子信标(CB[7]/Fc-MB)的应用研究P53基因作为人体内最重要的抑癌基因之一,约有50%以上的人类癌症肿瘤与P53基因突变紧密相关。而在P53基因的突变形式中,研究表明最主要的突变形式是以点突变引起的错义突变,约占总体的80%。因此,研发一种能高效、精确定量检测P53基因SNP突变的检测方法显得尤为重要。本文设计了一种基于主客体识别的新型电化学活性开关分子信标——CB[7]/Fc-MB。当没有目标DNA时,Fc-MB呈发卡型结构,MB两端的二茂铁基团靠的很近,由于空间位阻及分子尺寸大小不匹配,主体分子CB[7]不能识别包络二茂铁基团,此时检测到的电化学信号较高。当有目标DNA存在时,Fc-MB发卡型结构被打开,形成刚性DNA双螺旋结构,MB两端的二茂铁基团互相远离,此时,单个的二茂铁基团能够被CB[7]识别包络,使得二茂铁基团进入到CB[7]空腔内,因此,电化学信号降低,从而达到检测目标DNA (mutant DNA)的目的。实验结果表明,CB[7]/Fc-MB具有较好的特异性识别能力(识别率约为90%),且在10nM-50nM的浓度范围内,电化学信号变化值△I与目标DNA浓度之间呈良好的线性关系,线性方程为Y=1.73927X-8.50589(R2=0.99451),其检测限为7.8nM。