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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是广泛分布在农作物当中的一种霉菌代谢产物,可引起动物的生殖毒性。睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)是睾丸中的屏障细胞,其乳酸代谢的过程是维持睾丸内部能量稳态的重要过程。为揭示ZEA对雄性动物的生殖系统的影响及其机制,本试验以大鼠原代SCs建立ZEA体外中毒模型,利用Western Blot、RT-PCR、免疫荧光等技术,探讨了 ZEA对SCs乳酸代谢的影响及AMPK、SIRT1在ZEA致SCs乳酸代谢影响中发挥的作用。1、ZEA对SCs乳酸代谢过程的影响。利用不同浓度的ZEA(0,5,10,20μmol/L)作用于大鼠原代SCs不同时间(0,6,12,24,36,48 h),乳酸及丙酮酸试剂盒检测细胞内乳酸及丙酮酸水平;Western Blot检测乳酸产生相关蛋白表达;激光共聚焦检测乳酸关键蛋白LDHA的荧光强度;RT-PCR检测糖酵解关键基因表达。结果显示,随着ZEA染毒浓度的增大,SCs的细胞活性逐渐下降;细胞内的乳酸和丙酮酸浓度水平随着ZEA染毒浓度的增大而下降,且呈现时间依赖性下降;乳酸产生相关蛋白GLUT1、LDHA、MCT4呈现显著或极显著下降;免疫荧光结果表明,LDHA的荧光强度逐渐减弱;糖酵解关键基因HK1和Pgam1的表达呈现显著性下降。2、AMPK在ZEA致SCs乳酸下降中的作用。通过不同浓度的ZEA(0,5,10,20 μmol/L)作用于大鼠原代SCs,Western Blot检测AMPK的表达;通过20μmol/L ZEA 分别联合 AMPK 抑制剂 5 μmol/L Compound C、激活剂 50 μmol/L AICAR共同作用于SCs,乳酸及丙酮酸试剂盒检测细胞内乳酸及丙酮酸水平;Western Blot检测乳酸产生相关蛋白表达;RT-PCR检测糖酵解关键基因表达。结果显示,ZEA激活了 AMPK蛋白表达并抑制了 SCs内的ATP水平;通过ZEA联合AMPK抑制剂Compound C共同作用于SCs 24 h,与ZEA单独处理组相比,ZEA+Compound C共处理组丙酮酸、乳酸水平呈现极显著性上升,乳酸产生相关蛋白GLUT1、LDHA和MCT4的表达呈现显著或极显著性上升,糖酵解关键基因HK1、Gpi1呈现上升趋势,Pgam1呈现极显著上升趋势。ZEA与AMPK激活剂AICAR共同作用SCs,与ZEA处理组相比,ZEA+AICAR共处理组乳酸及丙酮酸浓度呈现显著性下降趋势,乳酸产生相关蛋白GLUT1、LDHA、MCT4的表达呈现显著性下降,糖酵解关键基因PFKP、Pgam1和HK1呈现显著性下降趋势。3、SIRT1在ZEA致SCs乳酸下降中的作用。通过不同浓度的ZEA(0,5,10,20 μmol/L)作用于大鼠原代SCs,Western Blot检测SIRT1的表达;通过20μmol/L ZEA与2.5 μmol/L RSV共同作用于SCs,乳酸及丙酮酸试剂盒检测细胞内乳酸及丙酮酸水平;Western Blot检测乳酸产生相关蛋白表达;RT-PCR检测糖酵解关键基因表达。结果显示,与对照组相比,SIRT1蛋白表达量呈现极显著性下降;利用ZEA联合SIRT1激活剂RSV共同作用于SCs 24 h,ZEA+RSV共处理组与ZEA单独处理组相比,丙酮酸水平呈现显著性上升,乳酸水平呈现上升趋势,乳酸产生相关蛋白GLUT1、LDHA、MCT4的表达呈现显著或极显著性上升,糖酵解关键基因PFKP、Pgam1呈现上升趋势,HK1呈现显著性上升趋势。全文结论:ZEA导致了 SCs糖酵解水平下降,丙酮酸及乳酸产生减少并呈现剂量及时间依赖性下降,说明ZEA干扰雄性动物精子发生过程的原因与其减少了 SCs对生殖细胞乳酸的供应有关。AMPK在ZEA致SCs乳酸下降中呈现正调控作用,SIRT1呈现负调控作用。