研究背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病患者病程进展中最常见的并发症,其主要病理改变是肾小球微血管发生病变,是糖尿病的微血管并发症,糖尿病肾病的总体疗效和远期预后较差,是导致糖尿病患者死亡的主要原因,糖尿病一旦发展到并发肾脏损害,多数患者就会很快进展到终末期肾脏病(end stage renal disease, ESRD)。一旦发展到ESRD,往往比其它肾脏疾病治疗更加棘手,另外终末期肾脏病医疗费用较高,不但给患者家庭带来沉重经济负担,也给国家带来沉重的社会负担,因此积极阐明其致病机制,寻找新的治疗靶点,开发新的药物,制定疗效更佳的防治措施显得尤为重要和迫切。目前糖尿病肾病发病机制仍不能明确,其发病机制复杂,近年来国内外研究认为体内长期持续高糖环境下形成的大量晚期糖基化终末产物(advanced glycationend products AGEs)在其整个病程进展中起到关键作用。糖尿病肾病发生的一个标志性事件就是肾小球微血管通透性增高形成微量蛋白尿。研究认为肾小球血管内皮细胞(glomerular endothelial cells, GECs)通透性的增加在蛋白尿的产生过程中起到关键性的作用,而血管内皮细胞通透性增高主要通过跨细胞途径来实现,即内皮细胞间连接破坏,从而导致血管内皮通透性增高使液体和大分子物质流出。而细胞间链接破坏主要是通过内皮细胞收缩,细胞形态变圆,细胞间隙增大,形成细胞旁通路等一系列细胞结构和功能变化来实现的。深入研究发现血管通透性增高关键环节是内皮细胞间连接的破坏和由此导致的细胞间裂隙形成,而细胞间裂隙形成是血液中大分子物质如白蛋白漏出血管壁的重要途径。血管内皮细胞的骨架蛋白和连接蛋白是构成血管内皮细胞屏障的主要物质基础。内皮细胞骨架特别是肌动蛋白在各种致病因素刺激下的重构和再分布是引起内皮细胞回缩、细胞形态及功能改变、细胞间裂隙的形成、通透性增高等一系列结构和功能改变的病理基础。肌动蛋白细胞骨架的装配和重构受到多个因素调控,其中Rac1信号是最关键的调控环节,而Rac1参与调控的具体机制目前仍不清楚,因此非常值得研究。研究表明AGEs可以引起皮肤微血管内皮细胞通透性的增加,并且AGEs以剂量和时问依赖的方式引起皮肽微血管内皮细胞通透性增加,因此,我们推测AGEs应该也能引起肾小球血管内皮细胞的通透性增高,从而进一步导致蛋白尿的发生,但国内这方面研究较少,因此非常值得研究。另外更重要的是开展此项研究对于阐明AGEs在糖尿病肾病发病和进展中起到怎样的作用及具体作用机制如何具有重要意义,有利于寻找新的更为有效的防治措施来防治糖尿病肾病这一临床难题。综合上述本研究进行如下设想来阐明(1) AGEs是否能够引起肾小球内皮细胞的通透性增高?(2) AGEs是否通过调节改变肾小球内皮细胞骨架蛋白F-actin及肌动蛋白结合蛋白cortactin的变化而调节其通透性?(3) AGEs是否通过Rac1信号通路调节肾小球内皮细胞通透性?为阐述上述问题本研究拟进行以下几个方面的工作。1.建立分离和培养原代大鼠肾小球内皮细胞的方法。2.观察AGEs刺激肾小球内皮细胞后其细胞通透性的改变情况及细胞骨架蛋白F-actin及cortactin形态学改变情况。3.观察AGEs刺激肾小球内皮细胞后其Rac1活性改变,探讨AGEs诱发肾小球内皮细胞通透性增加是否与Rac1信号通路有关。目的本研究的目的是想利用体外培养细胞实验来阐明：AGEs对体外培养大鼠GECs通透性的影响；AGEs对大鼠GECs骨架蛋白的结构和分布的影响及细胞形态学和功能的变化特征；AGEs介导大鼠GECs通透性变化的作用机制是否与Rac1信号通路有关?进一步为临床防治DN提供新的靶点和思路。方法体外培养大鼠原代GECs细胞,分别以不同浓度的AGEs修饰的人血清白蛋白(HSA)处理不同时间,并设立对照组进行比较。用免疫荧光染色法、激光共聚焦显微镜观察细胞骨架肌动蛋白F-actin,皮层肌动蛋白结合蛋白Cortactin的形态及分布；用Rac1激动剂O-Me-cAMP预处理细胞1h后,与前者进行对比,同时用pull-down assay法检测Rac1活性的变化；跨细胞电阻TER和FITC荧光标记白蛋白平均通透系数来检测单层GECs细胞通透性改变。结果1.肾组织块法行原代肾小球毛细血管内皮细胞分离、培养。倒置显微镜下观察,肾小球毛细血管内皮细胞形态学特征,并采用植物凝集素结合试验进行鉴定。2.用不同浓度剂量的AGEs刺激孵育8小时后,随着AGEs浓度的增加其单层GECs的TER平均值逐渐降低,FITC-BSA的平均通透系数逐渐增加。结果提示单层GECs通透性随AGEs浓度的增加而逐渐增高,表现为剂量依赖关系。相同浓度的AGEs (100μg/ml)刺激孵育单层GECs不同时间后,随着AGEs刺激时间延长,单层GECs的TER平均值逐渐降低,FITC-BSA的平均通透系数逐渐增加,提示单层GECs通透性随AGEs作用时间增加而逐渐增高,表现为时间依赖关系。3.正常情况下,未受AGEs刺激的GECs形态光滑完整,F-actin主要沿着细胞膜的周边、靠近细胞膜的内侧分布,表现围绕细胞膜周围分布状态,均匀分布,排列整齐,并呈网状分布排列,而细胞浆中分布较少,在细胞长轴方向、靠近细胞连接处呈细丝状排列,线条连续整齐。有很少量F-actin分布在细胞核的周围,形成核周骨架,细胞中央应力纤维不明显。而cortactin主要分布在皮质区和细胞膜上,形状较为规则,胞浆部位也有少量分布。随着AGEs-HSA浓度的增加或作用时间的增加,F-actin外周致密带边缘逐渐变得毛糙紊乱,排列不规整,逐渐出现典型的锯齿样结构。F-actin呈弥散分布在细胞内,F-actin重组和再分布,从细胞周边向细胞中心转移,并成平行束状堆积、增厚,细胞应力纤维逐渐增多,而胞浆中分布的cortactin逐渐变得明显增多且较紊乱,皮质区和细胞膜上的分布逐渐减少和不明显,出现移位分布,AGEs-HSA浓度达至100μg/mL时或作用时间达至8小时后,细胞边界模糊、有明显回缩趋势,这一作用具有明显的剂量依赖关系。而空白对照组和HSA蛋白对照组F-actin和cortactin形态及分布无明显影响。对细胞形态没有明显改变。4.用特异性激活剂O-Me-cAMP(2umol/ml)预处理内皮细胞后,AGEs-HSA诱导的内皮细胞F-actin结构重构、cortactin分布紊乱、中央应力纤维的形成及细胞形态的回缩的现象明显被抑制,HSA对细胞没有明显的作用。该结果提示Rac1信号通路参与了AGEs介导的GECs形态和结构的改变。5.与空白对照组相比,GECs经过AGEs-HA(100μg/ml)刺激培养8小时后其细胞内Rac1活性水平明显降低(P<0.01),但对Rac1总蛋白没有明显的影响,单独HSA没有这样的作用,该结果进一步提示Rac1在AGEs介导的内皮细胞功能改变中具有重要作用。6.Rac1激动剂O-Me-cAMP可有效抑制AGEs降低单层GECs的平均TER和有效抑制AGEs增加单层GECs的FITC-BSA通透系数的改变。提示Rac1激动剂O-Me-cAMP可以抑制由AGEs诱导的单层GECs通透性增加效应。结论1.AGEs能够增加大鼠GECs的通透性,且表现为剂量依赖关系和时间依赖关系。2. AGEs能够通过改变细胞骨架蛋白F-actin和皮质区肌动蛋白结合蛋白cortactin结构和分布影响大鼠GECs的形态和功能改变从而影响其通透性改变。3.Rac1信号通路在AGEs介导的大鼠GECs形态和功能改变中发挥了重要作用。