色谱复性是一种非常有效的蛋白质复性方法,尺寸排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱已经成功应用于很多蛋白质的复性中。原则上疏水作用介质能够捕捉具有暴露疏水部位的变性蛋白质和折叠中间体,从而抑制聚集发生,也可以应用于蛋白质复性。但商业化的疏水介质一般是针对于蛋白质分离而开发的,其疏水作用较强,不利于蛋白质的复性。因此有必要开发一种具有适当疏水强度的色谱介质,在抑制分子间聚集作用的同时又不会影响复性过程中的疏水塌缩,更好地实现复性。本文以三聚氯氰为连接臂,通过两步法将胆固醇修饰到Sepharose CL-6B介质上,合成出一种新型的疏水介质,构建了胆固醇配基色谱。在此基础上,选取还原变性的溶菌酶(Lys)为目标蛋白质,考察了稀释复性、胆固醇配基色谱穿过复性和吸附-洗脱复性这三种不同方法对复性效果的影响,研究结果表明:当上样量为0.25 mg Lys/ml介质时,采用吸附-洗脱方法可最终得到96.3%的蛋白收率和91.4%的活性收率,大大高于其它两种方法。圆二色光谱、荧光、HPLC检验结果进一步证明了该方法所得复性溶菌酶结构的正确性。在确定了疏水环境下吸附-盐酸胍梯度洗脱复性方法后,本文系统研究了流速、洗脱方式、胍梯度、上样浓度、上样量等操作条件对复性系统的影响。研究结果显示:在0.02 ml/min操作流速下用0.2柱体积(CV)盐酸胍梯度进行洗脱,即使上样量达到1 mg/ml,活性收率仍能达到85%。说明该方法能高效的实现蛋白质复性,有潜在的应用价值。